Berita

Strategi diagnostik tradisional untuk mendeteksi penyakit menular memerlukan penggunaan instrumen benchtop yang tidak cocok untuk pengujian point-of-care (POCT).Mikrofluida yang muncul adalah teknologi yang sangat mini, otomatis, dan terintegrasi yang merupakan alternatif potensial untuk metode tradisional untuk diagnostik di tempat yang cepat, murah, dan akurat.Metode diagnostik molekuler banyak digunakan dalam perangkat mikofluida sebagai metode yang paling efektif untuk deteksi patogen.Tinjauan ini merangkum kemajuan terbaru dalam diagnostik molekuler berbasis mikrofluida penyakit menular baik dari perspektif akademis dan industri.Pertama, kami menggambarkan pemrosesan asam nukleat pada chip yang khas, termasuk perlakuan awal sampel, amplifikasi, dan pembacaan sinyal.Karakteristik, kelebihan dan kekurangan dari keempat jenis platform mikofluida tersebut kemudian dibandingkan.Selanjutnya, kita akan membahas penggunaan uji digital untuk kuantifikasi mutlak asam nukleat.Baik perangkat diagnostik molekuler berbasis mikrofluida komersial klasik dan terbaru diringkas sebagai bukti keadaan pasar saat ini.Akhirnya, kami mengusulkan arah masa depan untuk diagnosis mikrofluida penyakit menular.
Penyakit menular disebabkan oleh patogen, termasuk bakteri, virus, dan parasit, yang tersebar di seluruh dunia.Tidak seperti penyakit lain, patogen cepat terinfeksi dan menyebar antara manusia dan hewan inang melalui media inokulasi, udara dan air [1].Pencegahan penyakit menular sangat penting sebagai tindakan kesehatan masyarakat.Tiga strategi utama untuk memerangi penyakit menular: (1) mengendalikan sumber infeksi;(2) gangguan jalur transmisi;(3) perlindungan populasi rentan.Di antara strategi utama, pengendalian sumber infeksi dianggap sebagai strategi yang paling penting karena kemudahan dan biayanya yang rendah.Diagnosis cepat, isolasi, dan pengobatan individu yang terinfeksi sangat penting, membutuhkan strategi diagnostik yang cepat, sensitif, dan akurat [2].Diagnosis penyakit menular saat ini biasanya menggabungkan pemeriksaan klinis berdasarkan tanda dan gejala dan studi laboratorium seperti kultur sel dan diagnostik molekuler, yang memerlukan tenaga terlatih, prosedur padat karya, dan peralatan pengujian yang mahal [3, 4].Pencegahan wabah penyakit menular membutuhkan diagnosis lokal yang cepat, murah, dan akurat, terutama di daerah terbatas sumber daya di mana penyakit menular sering terjadi dan parah [5], serta pengobatan di padang gurun atau di medan perang, di mana keadaan darurat tidak dapat diprediksi..perawatan medis terbatas [6].Dalam konteks ini, mikrofluida adalah teknologi yang menggabungkan teknologi sistem mikroelektromekanis, nanoteknologi, atau ilmu material untuk manipulasi cairan yang tepat [7,8,9,10], memberikan kemungkinan baru untuk deteksi titik perawatan (POCT).) agen infeksi di luar rumah sakit dan laboratorium.Dibandingkan dengan diagnostik tradisional yang memakan waktu, teknologi mikofluida menawarkan penghematan sampel dan biaya untuk diagnostik molekuler selama wabah penyakit.Penyebaran global penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) disebabkan oleh sindrom pernapasan akut coronavirus 2 (SARS-CoV-2), sehingga pentingnya mikrofluida untuk pencegahan dan pengendalian pandemi yang tepat waktu sekali lagi ditekankan [11, 12 , 13].Tidak seperti diagnostik tradisional, POCT mikofluida menggunakan perangkat portabel kecil mulai dari penganalisis benchtop hingga strip uji sidestream kecil untuk menguji di dekat titik pengambilan sampel [14].Tes ini menampilkan persiapan sampel yang sederhana atau tanpa persiapan, penguatan sinyal yang cepat, dan pembacaan sinyal yang sensitif yang menghasilkan durasi yang singkat dan hasil yang akurat dalam hitungan menit.Ketersediaan dan produksi massal instrumen perawatan kesehatan berbasis mikofluida telah memperluas aplikasi diagnostik langsung dan hemat biaya di luar rumah sakit, di dekat pasien, dan bahkan di rumah.
Di antara strategi yang ada untuk mendiagnosis penyakit menular, diagnostik molekuler adalah salah satu yang paling sensitif [15, 16].Selain itu, diagnostik molekuler sering digunakan sebagai standar emas untuk deteksi berkelanjutan COVID-19, yang memungkinkan deteksi langsung wilayah RNA atau DNA spesifik virus sebelum timbulnya respons imun [17, 18].Dalam tinjauan saat ini, kami menyajikan kemajuan terbaru dalam proses diagnostik molekuler berbasis mikrofluida untuk penyakit menular, dari perspektif akademis hingga perspektif industri masa depan (Gbr. 1).Kita akan mulai dengan tiga langkah kunci dalam pendeteksian asam nukleat: pra-perlakuan sampel on-chip, amplifikasi asam nukleat, dan pembacaan sinyal.Kami kemudian membandingkan berbagai jenis platform mikofluida dengan struktur dan fungsinya, menunjukkan karakteristik unik (kekuatan dan kelemahan).Deteksi asam nukleat digital dibahas lebih lanjut dan diberikan sebagai contoh teknologi generasi ketiga untuk kuantifikasi mutlak molekul patogen infeksius.Selain itu, beberapa perangkat POCT komersial yang khas dan terbaru akan disajikan untuk menunjukkan keadaan pasar POCT mikofluida saat ini untuk diagnostik molekuler.Kami juga akan membahas dan menjelaskan visi kami untuk aplikasi masa depan.
Modul chip mikrofluida untuk deteksi asam nukleat dapat dibagi menjadi tiga kategori (pengambilan sampel, pengenalan, dan pensinyalan) sesuai dengan fungsinya [19].Di antara modul-modul ini, modul pengambilan sampel terutama merealisasikan lisis sampel dan ekstraksi asam nukleat.Modul sensor terutama mengontrol konversi dan amplifikasi sinyal asam nukleat.Modul sinyal mendeteksi sinyal yang dikonversi dan diproses oleh modul penginderaan.Berdasarkan proses pendeteksian asam nukleat pada sebuah chip, kami akan merangkum berbagai chip yang dapat mewujudkan fungsi “input dan output”.
Langkah pertama dalam deteksi asam nukleat adalah ekstraksi asam nukleat, yaitu mengisolasi asam nukleat target dari sampel asli.Ekstraksi asam nukleat dilakukan untuk memurnikan asam nukleat dari kontaminan molekuler lainnya, memastikan integritas struktur utama molekul asam nukleat, dan mengoptimalkan hasil.Ekstraksi asam nukleat memerlukan lisis sampel dan penangkapan asam nukleat yang diperlukan, kualitas dan efisiensinya memiliki dampak besar pada penelitian dan hasil diagnostik.Setiap efek samping halus selama ekstraksi dapat membatasi deteksi lebih lanjut.Misalnya, metode polymerase chain reaction (PCR) dan loop isothermal amplification (LAMP) dihambat oleh beberapa pelarut organik sisa seperti etanol dan isopropanol dalam reagen isolasi asam nukleat [20].Ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat adalah metode yang paling populer untuk mengisolasi asam nukleat [21], namun, ekstraksi cair-cair pada chip sangat terbatas, karena reagen yang digunakan dalam ekstraksi cair-cair menyebabkan korosi pada sebagian besar chip mikrofluida. .Di sini, kami menyoroti metode ekstraksi fase padat berbasis microarray dan membandingkan kelebihan dan kekurangannya.
Silikon merupakan bahan substrat yang kompatibel dengan asam nukleat karena biokompatibilitas, stabilitas, dan kemudahan modifikasi [22].Yang penting, ketika dimodifikasi dengan silika atau bahan lain, komposit ini menunjukkan sifat untuk menyerap asam nukleat bermuatan negatif di bawah pH rendah, kondisi garam tinggi saat dielusi dengan pH tinggi, larutan garam rendah.Berdasarkan fenomena ini, dimungkinkan untuk memurnikan asam nukleat.
Berbagai bentuk bahan berbasis silika telah digunakan untuk ekstraksi asam nukleat dalam mikofluida, seperti manik-manik silika, bubuk, filter mikrofiber, dan membran silika [23, 24, 25, 26].Tergantung pada sifat materialnya, material berbasis silikon dapat digunakan dalam sirkuit mikro dengan cara yang berbeda.Misalnya, butiran silika, bubuk, dan nanofilter komersial dapat dengan mudah ditempatkan ke dalam pori-pori atau saluran mikro chip mikofluida dan membantu mengekstrak asam nukleat dari sampel [27, 28, 29].Membran silika yang dimodifikasi permukaan juga dapat digunakan untuk memurnikan DNA dengan cepat dari patogen dengan biaya rendah.Misalnya, Wang dkk.[30] Dengan menggabungkan reaksi amplifikasi denaturasi dengan pertukaran rantai yang dimediasi vesikel dengan membran silika yang dilapisi dengan oligosakarida kitosan, sistem portabel serbaguna diperkenalkan yang berhasil mendeteksi 102-108 unit pembentuk koloni.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., dan keberadaan virus mudah terlihat.Powell dkk.[31] Microarray berbasis silikon kemudian digunakan untuk mendeteksi virus hepatitis C (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), virus Zika, dan human papillomavirus dan propagasi otomatis, di mana mikroreaktor berliku-liku 1,3 l dikembangkan untuk menangkap virus RNA.dan melakukan amplifikasi in situ.Selain metode ini, mikrokolom silika yang dimodifikasi permukaan juga memainkan peran kunci dalam ekstraksi asam nukleat, karena geometri dan sifat bahan pengubah sangat meningkatkan efisiensi ekstraksi.Chen dkk.[32] mengusulkan platform mikofluida untuk isolasi RNA konsentrasi rendah berdasarkan mikrokolom silikon berlapis amino.Perangkat mikofluida ini mengintegrasikan susunan mikropilar 0,25 cm2 pada substrat silikon untuk mencapai efisiensi ekstraksi yang lebih tinggi melalui desain rasio luas permukaan dan volume yang tinggi.Keuntungan dari desain ini adalah bahwa perangkat mikofluida dapat mencapai efisiensi ekstraksi asam nukleat hingga 95%.Strategi berbasis silikon ini menunjukkan nilai cepat mengisolasi asam nukleat dengan biaya rendah.Dalam kombinasi dengan chip mikrofluida, strategi ekstraksi berbasis silikon tidak hanya dapat meningkatkan efisiensi deteksi asam nukleat, tetapi juga memfasilitasi miniaturisasi dan integrasi perangkat analitis [20].
Metode pemisahan magnetik menggunakan partikel magnetik untuk mengisolasi asam nukleat dengan adanya medan magnet eksternal.Partikel magnetik yang umum digunakan antara lain partikel magnetik Fe3O4 atau -Fe2O3 yang dilapisi silika, amino dan karboksil [33,34,35,36].Fitur yang membedakan partikel magnetik dibandingkan dengan metode SPE berbasis silikon adalah kemudahan manipulasi dan kontrol dengan magnet eksternal.
Menggunakan interaksi elektrostatik antara asam nukleat dan silika, dalam kondisi garam tinggi dan pH rendah, asam nukleat teradsorpsi pada permukaan partikel magnetik berlapis silika, sedangkan dalam kondisi garam rendah dan pH tinggi, molekul dapat dicuci lagi..Manik-manik magnetik berlapis silika memungkinkan untuk mengekstrak DNA dari sampel volume besar (400 L) menggunakan gerakan yang dikendalikan secara magnetis [37].Sebagai demonstrasi, Rodriguez-Mateos dkk.[38] menggunakan magnet merdu untuk mengontrol transfer manik-manik magnetik ke ruang yang berbeda.Berdasarkan partikel magnetik berlapis silika, 470 salinan/mL RNA genomik SARS-CoV-2 dapat diekstraksi dari sampel air limbah untuk deteksi transkripsi balik LAMP (RT-LAMP) dan responsnya dapat dibaca dalam waktu 1 jam.mata telanjang (Gbr. 2a).
Perangkat berdasarkan bahan magnetik dan berpori.Diagram konseptual perangkat mikrofluida IFAST RT-LAMP untuk deteksi RNA SARS-CoV-2 (diadaptasi dari [38]).b Perangkat mikro sentrifugal untuk dSPE asam nukleat usap bukal (diadaptasi dari [39]).c Konsentrator sampel swadaya terpasang menggunakan kartu FTA® (diadaptasi dari [50]).d Kertas saring Fusion 5 dimodifikasi dengan kitosan (diadaptasi dari [51]).SARS-CoV-2 sindrom pernapasan akut coronavirus 2, RT-LAMP loop transkripsi terbalik yang dimediasi amplifikasi isotermal, mitra teknologi pencari FTA, asam nukleat NA
Partikel magnetik bermuatan positif ideal untuk menempelkan tulang punggung fosfat dari asam nukleat.Pada konsentrasi garam tertentu, gugus fosfat yang bermuatan negatif dari asam nukleat dapat bermuatan positif pada permukaan partikel komposit magnetik.Oleh karena itu, nanopartikel magnetik dengan permukaan kasar dan kepadatan tinggi gugus amino dikembangkan untuk ekstraksi asam nukleat.Setelah pemisahan dan pemblokiran magnetik, nanopartikel magnetik dan kompleks DNA dapat langsung digunakan dalam PCR, yang menghilangkan kebutuhan untuk operasi pemurnian dan elusi yang kompleks dan memakan waktu [35].Nanopartikel magnetik yang dilapisi dengan gugus karboksil negatif juga telah digunakan untuk memisahkan asam nukleat yang teradsorpsi pada permukaan dalam larutan polietilen glikol dan natrium klorida konsentrasi tinggi [36].Dengan manik-manik magnetik yang dimodifikasi permukaan ini, ekstraksi DNA kompatibel dengan amplifikasi berikutnya.Dignan dkk.[39] menggambarkan platform mikrofluida sentrifugal otomatis dan portabel untuk pretreatment asam nukleat, memungkinkan personel non-teknis untuk menggunakannya di lokasi.Selain itu, kompatibilitas DNA yang diisolasi dengan LAMP, metode yang cocok untuk analisis asam nukleat di tempat perawatan, lebih lanjut menunjukkan persyaratan peralatan minimal dan kesesuaian untuk pengujian kolorimetri (Gbr. 2b).
Metode manik magnetik menawarkan kemungkinan ekstraksi otomatis, beberapa di antaranya ada di ekstraktor asam nukleat otomatis komersial [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, AS), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Cina) dan Biomek®;Beckman (Miami, AS).), Florida, AS)].Keuntungan menggabungkan manik-manik magnetik dengan mikrofluida dapat digunakan untuk ekstraksi asam nukleat otomatis yang efisien, yang berpotensi memajukan pengembangan diagnostik molekuler;namun, kombinasi manik-manik magnetik dengan mikrofluida masih sangat bergantung pada sistem kontrol kompleks untuk manipulasi manik-manik magnetik yang tepat, yang menjelaskan popularitas produk komersial yang besar dan mahal, yang membatasi penerapan lebih lanjut dari manik-manik magnetik di POCT.
Beberapa bahan berpori seperti filter nitroselulosa yang dimodifikasi, kartu Finders Technology Associates (FTA), kertas filter berbasis polietersulfon, dan bahan berlapis glikan juga telah digunakan untuk deteksi asam nukleat [40, 41, 42, 43, 44].Bahan berserat berpori seperti kertas berserat pertama kali digunakan untuk mengisolasi DNA dengan mengikat molekul DNA untai panjang secara fisik dengan serat.Pori-pori kecil menyebabkan pembatasan fisik yang kuat dari molekul DNA, yang secara positif mempengaruhi ekstraksi DNA.Karena ukuran pori kertas berserat yang berbeda, efisiensi ekstraksi tidak dapat memenuhi kebutuhan amplifikasi DNA [45, 46].Kartu FTA adalah kertas saring komersial yang digunakan di bidang kedokteran forensik dan banyak digunakan di bidang diagnostik molekuler lainnya.Melalui penggunaan kertas saring selulosa yang diresapi dengan berbagai bahan kimia untuk melisiskan membran sel dalam sampel, DNA yang dilepaskan dilindungi dari degradasi hingga 2 tahun.Baru-baru ini, kertas selulosa yang diresapi telah dikembangkan untuk deteksi molekuler dari berbagai patogen, termasuk SARS-CoV-2, leishmaniasis, dan malaria [47,48,49].HIV dalam plasma terisolasi dilisiskan secara langsung, dan asam nukleat virus diperkaya dalam membran aliran FTA® yang dibangun ke dalam konsentrator, yang memungkinkan produksi asam nukleat secara efisien [50] (Gbr. 2c).Masalah utama dengan deteksi asam nukleat menggunakan kartu FTA adalah bahwa bahan kimia seperti guanidin dan isopropanol menghambat reaksi amplifikasi berikutnya.Untuk mengatasi masalah ini, kami mengembangkan kertas saring termodifikasi kitosan Fusion 5, yang menggabungkan keuntungan dari jalinan fisik molekul DNA dan kertas saring berserat, dan adsorpsi elektrostatik DNA pada senyawa termodifikasi kitosan untuk mencapai ekstraksi asam nukleat yang sangat efisien. ..serat filter [51] (Gbr. 2d).Demikian pula, Zhu et al.[52] mendemonstrasikan metode PCR yang dimodifikasi kitosan berdasarkan sistem mikofluida kapiler in situ untuk isolasi cepat dan deteksi RNA virus Zika.Asam nukleat masing-masing dapat diadsorpsi/desorbsi dalam media lisat/PCR campuran, berdasarkan sifat sakelar on/off kitosan.hidup dan mati”, responsif terhadap pH.
Seperti disebutkan di atas, strategi ini menggabungkan keunggulan berbagai bahan fase padat dan meningkatkan efisiensi ekstraksi asam nukleat dalam mikofluida.Dalam aplikasi praktis, penggunaan bahan-bahan ini dalam jumlah besar tidak ekonomis, dan perawatan permukaan yang tepat atau modifikasi permukaan bahan umum dengan bahan-bahan ini juga dapat mempertahankan fungsinya.Oleh karena itu, diyakini bahwa penerapan strategi ini setelah studi percontohan dapat mengurangi biaya.
Pengujian asam nukleat pada platform mikofluida sering menggunakan volume sampel kecil (< 100 l), oleh karena itu memerlukan amplifikasi asam nukleat target dengan probe khusus untuk konversi ke sinyal yang nyaman untuk deteksi hilir (optik, listrik, dan magnetik) [53, 54]. Pengujian asam nukleat pada platform mikofluida sering menggunakan volume sampel kecil (< 100 l), oleh karena itu memerlukan amplifikasi asam nukleat target dengan probe khusus untuk konversi ke sinyal yang nyaman untuk deteksi hilir (optik, listrik, dan magnetik) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Saat menguji asam nukleat pada platform mikofluida, volume sampel kecil (<100 L) sering digunakan, sehingga amplifikasi asam nukleat target dengan probe khusus diperlukan untuk mengubahnya menjadi sinyal yang nyaman untuk deteksi berikutnya (optik, listrik, dan magnetik) [53, 54].< 100 l），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。平台 上 检测 使用 <100 l） ， 因此 特定 探针 ， 下游 、 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Deteksi asam nukleat pada platform mikofluida biasanya menggunakan volume sampel kecil (<100 l), yang memerlukan amplifikasi asam nukleat target dengan probe khusus untuk mengubahnya menjadi sinyal untuk deteksi selanjutnya (optik, listrik, dan magnetik) [53, 54]] .Amplifikasi asam nukleat dalam mikofluida juga dapat mempercepat reaksi, mengoptimalkan batas deteksi, mengurangi kebutuhan sampel, dan meningkatkan akurasi deteksi [55, 56].Dalam beberapa tahun terakhir, dengan realisasi deteksi yang cepat dan akurat, berbagai metode amplifikasi asam nukleat telah diterapkan dalam mikrofluida, termasuk PCR dan beberapa reaksi amplifikasi isotermal.Bagian ini akan merangkum metode untuk deteksi asam nukleat berdasarkan sistem mikofluida.
PCR adalah simulasi proses replikasi DNA suatu organisme, teori yang dijelaskan secara rinci di tempat lain dan tidak akan dibahas di sini.PCR dapat mengamplifikasi sejumlah kecil DNA/RNA target dengan kecepatan eksponensial, menjadikan PCR alat yang ampuh untuk deteksi cepat asam nukleat.Dalam beberapa dekade terakhir, banyak perangkat mikofluida portabel yang dilengkapi dengan sistem siklus termal PCR telah dikembangkan untuk memenuhi kebutuhan diagnostik titik perawatan [57, 58].PCR on-chip dapat dibagi menjadi empat jenis (konvensional, aliran kontinu, spasial diaktifkan, dan PCR konvektif) menurut metode kontrol suhu yang berbeda [59].Misalnya, Gee et al.[60] mengembangkan metode PCR kuantitatif transkripsi balik langsung (RT-qPCR) pada platform mikofluida mereka sendiri untuk deteksi multipleks virus SARS-CoV-2, influenza A dan B dalam sampel usap tenggorokan (Gbr. 3a).Taman dkk.[61] membangun chip analisis patogen sederhana dengan mengintegrasikan PCR film tipis, elektroda, dan modul mikrofluida berbasis polidimetilsiloxane yang dioperasikan dengan jari.Namun, keduanya bekerja mewujudkan kekurangan umum PCR konvensional.PCR membutuhkan siklus termal, yang membatasi miniaturisasi perangkat lebih lanjut dan mengurangi waktu pengujian.
Pengembangan PCR mikrofluida dan space-switched berbasis aliran kontinu sangat penting untuk mengatasi masalah ini.Menggunakan saluran panjang berbelit-belit atau saluran lurus pendek, PCR aliran kontinu dapat memberikan amplifikasi cepat dengan reagen yang bersirkulasi secara aktif di tiga zona pemanasan awal dengan pompa off-chip.Operasi ini berhasil menghindari fase transisi antara suhu reaksi yang berbeda dan dengan demikian secara signifikan mengurangi waktu pengujian [62] (Gbr. 3b).Dalam studi lain oleh Jung et al.[63] mengusulkan penganalisis genetik PCR putar baru yang menggabungkan karakteristik PCR tetap dan aliran untuk PCR transkripsi balik ultrafast dan multipleks (Gbr. 3c).Untuk amplifikasi asam nukleat, microchip PCR akan diputar melalui tiga blok pemanas pada suhu yang berbeda: 1. Blok denaturasi 94°C, 2. Blok Annealing pada 58°C, 3. Blok ekspansi pada 72°C.
Penerapan PCR dalam mikofluida.Representasi skema dirRT-qPCR pada platform mikofluida (diadaptasi dari [60]).b Representasi skema dari microarray PCR aliran kontinu berdasarkan saluran serpentine (diadaptasi dari [62]).c Representasi skema dari penganalisis genetik PCR putar, yang terdiri dari microchip, tiga blok pemanas dan motor stepper (diadaptasi dari [63]).d Diagram PCR termokonveksi dengan sentrifugasi dan pengaturan (diadaptasi dari [64]).DirRT-qPCR, reaksi berantai polimerase transkripsi terbalik kuantitatif langsung
Menggunakan kapiler dan loop atau bahkan pelat tipis, PCR konveksi dapat dengan cepat memperkuat asam nukleat dengan konveksi termal bebas alami tanpa memerlukan pompa eksternal.Sebagai contoh, platform mikrofluida polimer olefin siklik dikembangkan pada tahap pemanasan berputar fabrikasi yang menggunakan siklus termal dengan sentrifugasi dalam saluran mikro loop PCR [64] (Gbr. 3d).Solusi reaksi didorong oleh konveksi termal, yang terus-menerus menukar suhu tinggi dan rendah dalam saluran mikro dengan struktur annular.Seluruh proses amplifikasi dapat diselesaikan dalam waktu 10 menit dengan batas deteksi 70,5 pg/channel.
Seperti yang diharapkan, PCR cepat adalah alat yang ampuh untuk diagnostik molekuler respons sampel dan sistem analisis multipleks yang terintegrasi penuh.PCR cepat secara signifikan mengurangi waktu yang diperlukan untuk mendeteksi SARS-CoV-2, yang berkontribusi pada pengendalian pandemi COVID-19 yang efektif.
PCR membutuhkan siklus termal kompleks yang tidak cocok untuk POCT.Baru-baru ini, teknik amplifikasi isotermal telah diterapkan pada mikofluida, termasuk tetapi tidak terbatas pada LAMP, recombinase polymerase amplification (RPA), dan amplifikasi berdasarkan urutan asam nukleat [65,66,67,68].Dengan teknik ini, asam nukleat diperkuat pada suhu konstan, memfasilitasi pembuatan perangkat POCT portabel yang sangat sensitif dan berbiaya rendah untuk diagnostik molekuler.
Uji LAMP berbasis mikrofluida dengan throughput tinggi memungkinkan beberapa deteksi penyakit menular [42, 69, 70, 71].Dalam kombinasi dengan sistem mikrofluida sentrifugal, LAMP selanjutnya dapat memfasilitasi otomatisasi deteksi asam nukleat [69, 72, 73, 74, 75].SlipChip spin-and-react dikembangkan untuk deteksi visual beberapa bakteri paralel menggunakan LAMP [76] (Gbr. 4a).Saat menggunakan LAMP yang dioptimalkan dalam pengujian, rasio signal-to-noise fluoresensi kira-kira 5 kali lipat, dan batas deteksi mencapai 7,2 salinan/μl DNA genom. Selain itu, keberadaan lima bakteri patogen pencernaan yang umum, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, divisualisasikan berdasarkan metode dalam <60 menit. Selain itu, keberadaan lima bakteri patogen pencernaan yang umum, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, divisualisasikan berdasarkan metode dalam <60 menit.Selain itu, keberadaan lima bakteri patogen umum pada saluran pencernaan, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, divisualisasikan menggunakan metode ini dalam waktu kurang dari 60 menit.<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。， 基于 在 <60 内 视化 了 种 常见 细菌病 的 包括 肠杆菌 氏 和HIPSelain itu, adanya lima bakteri patogen gastrointestinal yang umum, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius, dan Vibrio parahaemolyticus, divisualisasikan menggunakan metode ini dalam waktu kurang dari 60 menit.
Keunggulan LAMP dalam mikrofluida antara lain respon cepat dan deteksi miniatur.Namun, karena suhu reaksi (sekitar 70 ° C), aerosol pasti dihasilkan selama LAMP, menghasilkan tingkat positif palsu yang tinggi.Spesifisitas pengujian, desain primer, dan kontrol suhu juga perlu dioptimalkan untuk LAMP.Selain itu, desain chip yang menerapkan beberapa deteksi target pada satu chip sangat berharga dan harus dikembangkan.Selain itu, LAMP cocok untuk deteksi multiguna yang terintegrasi dalam satu chip, yang sangat penting, tetapi masih ada banyak ruang untuk pengembangan.
Laju positif palsu yang tinggi dari LAMP dapat dikurangi sebagian dengan RPA, karena suhu reaksi yang relatif rendah (~37 °C) menghasilkan masalah penguapan yang relatif sedikit [77].Dalam sistem RPA, dua primer yang berlawanan memulai sintesis DNA dengan mengikat rekombinase dan amplifikasi dapat diselesaikan dalam waktu 10 menit [78,79,80,81].Oleh karena itu, seluruh proses RPA jauh lebih cepat daripada PCR atau LAMP.Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi mikofluida telah terbukti lebih meningkatkan kecepatan dan akurasi RPA [82,83,84].Misalnya, Liu et al.[85] mengembangkan uji amplifikasi rekombinase polimerase aliran lateral terintegrasi mikrofluida untuk deteksi cepat dan sensitif SARS-CoV-2 dengan mengintegrasikan transkripsi balik RPA (RT-RPA) dan sistem deteksi strip uji aliran lateral universal.menjadi satu sistem mikrofluida.Gambar 4b).Batas deteksi adalah 1 salinan/µl atau 30 salinan/sampel, dan deteksi dapat diselesaikan dalam waktu sekitar 30 menit.Kong dkk.telah mengembangkan perangkat mikofluida yang dapat dipakai.[86] menggunakan suhu tubuh dan sistem deteksi fluoresensi berbasis ponsel untuk mendeteksi DNA HIV-1 secara cepat dan langsung menggunakan RPA (Gambar 4c).Uji RPA yang dapat dipakai mendeteksi 100 salinan/mL dari urutan target dalam waktu 24 menit, menunjukkan potensi besar untuk diagnosis cepat bayi terinfeksi HIV-1 di rangkaian terbatas sumber daya.
Amplifikasi isotermal dalam pengujian titik perawatan (POCT).Pengembangan dan produksi putaran dan reaksi SlipChip.Setelah pengelasan plasma, chip atas dan bawah dirakit dengan satu set mur untuk membentuk chip akhir (diadaptasi dari [76]).b Skema sistem MI-IF-RPA untuk deteksi COVID-19 (diadaptasi dari [85]).c Skema tes RPA yang dapat dipakai untuk deteksi cepat DNA HIV-1 (diadaptasi dari [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, human immunodeficiency virus HIV, RPA recombinase polymerase amplification, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase Flow Amplifikasi
RPA berbasis mikrofluida berkembang pesat, namun biaya fabrikasi chip dan konsumsi reaksi terlalu tinggi dan harus dikurangi untuk meningkatkan ketersediaan teknologi ini.Selain itu, sensitivitas RPA yang tinggi dapat mempengaruhi amplifikasi produk non-spesifik, terutama dengan adanya kontaminasi.Keterbatasan ini dapat mempengaruhi penerapan RPA dalam sistem mikofluida dan memerlukan optimasi lebih lanjut.Primer dan probe yang dirancang dengan baik untuk berbagai target juga diperlukan untuk meningkatkan kelayakan strategi mikofluida berbasis RPA di POCT.
Cas13 dan Cas12a memiliki kemampuan untuk secara acak membelah asam nukleat dan dengan demikian dapat dikembangkan sebagai alat deteksi dan diagnostik.Cas13 dan Cas12a masing-masing diaktifkan setelah mengikat DNA atau RNA target.Setelah diaktifkan, protein mulai membelah asam nukleat terdekat lainnya, setelah itu RNA pemandu yang menargetkan asam nukleat spesifik patogen dapat membelah probe fluoresen yang dipadamkan dan melepaskan fluoresensi.Berdasarkan teori ini, Kellner et al.[87] mengembangkan metode berbasis Cas13 [Spesifik High-sensitivity Enzymatic Reporter UNLOCKING (SHERLOCK)], dan Broughton et al.[88] mengembangkan pendekatan lain berdasarkan Cas12a [CRISPR Trans Reporter menargetkan DNA endonuclease (DTECR)].
Dalam beberapa tahun terakhir, berbagai metode untuk mendeteksi asam nukleat berdasarkan CRISPR telah muncul [89, 90].Metode konvensional berbasis CRISPR seringkali memakan waktu dan tenaga karena beberapa prosedur termasuk ekstraksi asam nukleat, amplifikasi dan deteksi CRISPR.Paparan cairan ke udara dapat meningkatkan kemungkinan hasil positif palsu.Mengingat hal di atas, sistem berbasis CRISPR sangat membutuhkan pengoptimalan.
Platform mikrofluida yang dikontrol secara pneumatik yang dapat melakukan 24 analisis secara paralel telah dikembangkan untuk aplikasi deteksi CRISPR-Cas12a dan CRISPR-Cas13a [91].Sistem ini dilengkapi dengan perangkat pendeteksi fluoresensi yang melewati amplifikasi asam nukleat dan secara otomatis mendeteksi sampel DNA dan RNA femtomolar.Chen dkk.[92] amplifikasi rekombinase terintegrasi dengan sistem CRISPR-Cas12a dalam mikrofluida sentrifugal (Gbr. 5a).Pekerjaan ini mengatasi kesulitan dalam mengintegrasikan kedua proses ini karena Cas12a dapat mencerna DNA pembawa pesan dan menghambat proses amplifikasi.Selain itu, Chen dkk.[92] tambahan pra-disimpan reagen reaksi dalam kontrol mikofluida sentrifugal untuk secara otomatis menyelesaikan seluruh proses.Dalam karya lain, Silva dkk.[93] mengembangkan metode diagnostik tanpa amplifikasi CRISPR/Cas12a dan smartphone untuk mendeteksi SARS-CoV-2 (Gbr. 5b).Pengujian ini, yang dikenal sebagai sistem bebas amplifikasi berbasis ponsel, mencakup enzim yang bergantung pada CRISPR/Cas yang didasarkan pada visualisasi ponsel cerdas dari sinyal gelembung yang dihasilkan katalase dalam saluran mikofluida.Deteksi sensitif kurang dari 50 salinan/µl asam nukleat tanpa pra-amplifikasi, seluruh proses dari injeksi sampel hingga pembacaan sinyal hanya membutuhkan waktu 71 menit.
Metode deteksi asam nukleat berdasarkan CRISPR.POCT sentrifugal untuk diagnostik molekuler terintegrasi berdasarkan CRISPR (diadaptasi dari [92]).b Pengembangan tes CASCADE untuk analisis SARS-CoV-2 berbasis smartphone (diadaptasi dari [93]).Amplifikasi rekombinasi RAA, motif protospacer yang berdekatan dengan PAM, pengulangan palindromik pendek berkerumun CRISPR secara berkala, sistem CASCADE tanpa amplifikasi ponsel dengan enzim yang bergantung pada CRISPR/CAS, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC
Sebagai langkah terakhir dalam deteksi asam nukleat, deteksi sinyal secara langsung mencerminkan hasil diagnostik dan merupakan faktor penting dalam pengembangan POCT yang efisien, sensitif, dan akurat.Sinyal dapat dibaca menggunakan berbagai metode seperti strategi fluoresen, elektrokimia, kolorimetri, dan magnetik.Pada bagian ini, kami menjelaskan alasan untuk setiap pendekatan dan membandingkan diagnostik molekuler penyakit menular dalam mikofluida.
Strategi berbasis fluoresensi banyak digunakan untuk diagnostik POCT penyakit menular karena keunggulannya yang luar biasa dari sensitivitas yang sangat baik, biaya rendah, kemudahan operasi, dan analisis titik perawatan [94, 95].Strategi ini menggunakan fluorofor berlabel seperti pewarna fluoresen dan bahan nano untuk membuat sinyal yang dapat dideteksi (peningkatan fluoresensi atau pendinginan).Temuan ini menunjukkan bahwa strategi berbasis fluoresensi dapat dibagi menjadi pelabelan fluoresen langsung, deteksi sinyal-on, dan deteksi fluoresen sinyal-off [96].Deteksi label fluoresen langsung menggunakan label fluoresen khusus untuk memberi label pada ligan tertentu yang menghasilkan sejumlah fluoresensi saat terikat secara selektif ke target.Untuk deteksi fluoresensi berbasis sinyal, kualitas sinyal fluoresen berhubungan positif dengan besarnya minat.Intensitas fluoresensi dapat diabaikan tanpa adanya target dan dapat dideteksi ketika jumlah target yang cukup ada.Sebaliknya, intensitas fluoresensi yang dideteksi oleh fluoresensi “signal-off” berbanding terbalik dengan jumlah target, awalnya mencapai nilai maksimum dan secara bertahap menurun saat target diperbesar.Misalnya, menggunakan mekanisme trans-cleavage yang bergantung pada target CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] mengembangkan strategi pengenalan baru untuk mendeteksi RNA yang melewati transkripsi terbalik secara langsung (Gbr. 6a).Setelah mengikat RNA target komplementer, kompleks CRISPR-Cas13-RNA dapat diaktifkan, memicu pembelahan transkolateral oleh RNA reporter non-spesifik.Reporter berlabel fluoresensi [fluorofor (F)] dipadamkan oleh quencher (Q) utuh dan berpendar ketika dibelah oleh kompleks yang diaktifkan.
Keuntungan dari deteksi elektrokimia adalah kecepatan deteksi tinggi, produksi mudah, biaya rendah, mudah dibawa dan kontrol otomatis.Ini adalah metode analisis yang kuat untuk aplikasi POCT.Berdasarkan transistor efek medan graphene Gao et al.[98] mengembangkan nanobiosensor untuk deteksi multipleks antigen penyakit Lyme dari bakteri Borrelia burgdorferi dengan batas deteksi 2 pg/mL (Gbr. 6b).
Uji kolorimetri telah digunakan dalam aplikasi POCT, diuntungkan dari keunggulan portabilitas, biaya rendah, kemudahan persiapan, dan pembacaan visual.Deteksi kolorimetri dapat menggunakan oksidasi peroksidase atau bahan nano mirip peroksidase, agregasi bahan nano, dan penambahan pewarna indikator untuk mengubah informasi tentang keberadaan asam nukleat target menjadi perubahan warna yang terlihat [99, 100, 101].Khususnya, nanopartikel emas banyak digunakan dalam pengembangan strategi kolorimetri, dan karena kemampuannya untuk menginduksi perubahan warna yang cepat dan signifikan, ada peningkatan minat dalam pengembangan platform kolorimetri POCT untuk diagnosis in situ penyakit menular [102].Dengan perangkat mikrofluida sentrifugal terintegrasi [103], patogen bawaan makanan dalam sampel susu yang terkontaminasi dapat dideteksi secara otomatis pada tingkat 10 sel bakteri, dan hasilnya dapat dibaca secara visual dalam waktu 65 menit (Gbr. 6c).
Teknik penginderaan magnetik dapat secara akurat mendeteksi analit menggunakan bahan magnetik, dan telah ada minat yang signifikan dalam aplikasi POCT dalam beberapa dekade terakhir.Teknik penginderaan magnetik memiliki beberapa keunggulan unik seperti bahan magnetik biaya rendah daripada komponen optik mahal.Namun, penggunaan medan magnet meningkatkan efisiensi deteksi dan mengurangi waktu persiapan sampel [104].Selain itu, hasil penyelidikan magnetik menunjukkan spesifisitas yang tinggi, sensitivitas, dan rasio signal-to-noise yang tinggi karena sinyal latar belakang magnetik sampel biologis yang tidak signifikan [105].Sharma dkk.mengintegrasikan biosensor berbasis persimpangan terowongan magnetik ke dalam platform microchip portabel.[106] untuk deteksi multipleks patogen (Gbr. 6d).Biosensor secara sensitif mendeteksi asam nukleat subnanomolar yang diisolasi dari patogen.
Metode deteksi sinyal tipikal.Konsep deteksi hyperlocalized Cas13a (diadaptasi dari [97]).b Graphene nanobiosensor FET dalam kombinasi dengan Lyme GroES scFv (diadaptasi dari [98]).c Indikasi kolorimetri untuk deteksi multipleks patogen bawaan makanan dalam chip mikofluida sentrifugal: sampel No. 1 dan No. 3 dengan patogen target, dan sampel No. 2, No. 4 dan No. 5 tanpa patogen target (diadaptasi dari [103]) .d Biosensor berdasarkan persimpangan terowongan magnetik, termasuk platform, penguat pemblokiran built-in, unit kontrol, dan catu daya untuk pembangkitan/akuisisi sinyal (diadaptasi dari [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metakrilat
Meskipun karakteristik yang sangat baik dari metode deteksi di atas, mereka masih memiliki kelemahan.Metode ini dibandingkan (tabel 1), termasuk beberapa aplikasi dengan detail (pro dan kontra).
Dengan perkembangan mikrofluida, sistem mikroelektromekanik, nanoteknologi dan ilmu material, penggunaan chip mikofluida untuk mendeteksi penyakit menular terus meningkat [55,96,107,108].Manipulasi yang tepat dari peralatan mini dan cairan berkontribusi pada akurasi diagnostik dan efektivitas biaya.Oleh karena itu, untuk pengembangan lebih lanjut, telah dilakukan upaya untuk mengoptimalkan dan meng-upgrade chip, sehingga menghasilkan berbagai chip mikofluida dengan struktur dan fungsi yang berbeda.Di sini kami secara singkat memperkenalkan beberapa jenis platform mikofluida yang umum dan membandingkan karakteristiknya (pro dan kontra).Selain itu, sebagian besar contoh yang tercantum di bawah ini terutama berfokus pada memerangi SARS-CoV-2.
LOCC adalah sistem analitik kompleks miniatur yang paling umum dan operasinya sangat miniatur, terintegrasi, otomatis, dan paralel dari injeksi dan preparasi sampel, kontrol aliran, dan deteksi cairan [109, 110].Cairan dimanipulasi melalui geometri yang dirancang dengan hati-hati dan interaksi banyak efek fisik seperti gradien tekanan, aksi kapiler, elektrodinamika, medan magnet, dan gelombang akustik [111].LOCC menunjukkan keunggulan luar biasa dalam penyaringan throughput tinggi dan deteksi ganda, dengan kecepatan analisis yang cepat, ukuran sampel yang kecil, konsumsi daya yang rendah, dan efisiensi manajemen dan operasi yang tinggi;namun, perangkat LOCC sangat halus, dan manufaktur, pengemasan, dan antarmuka.Namun, multiplexing dan reuse menghadapi kesulitan besar [96].Dibandingkan dengan platform lain, LOCC memiliki keunggulan unik dalam hal keragaman aplikasi maksimum dan kompatibilitas teknologi terbaik, tetapi kelemahannya juga jelas, yaitu kompleksitas tinggi dan pengulangan yang buruk.Ketergantungan pada pompa eksternal, yang seringkali besar dan mahal, semakin membatasi penggunaannya dalam POCT.
Selama wabah COVID-19, LOCC mendapat banyak perhatian.Pada saat yang sama, ada beberapa chip baru yang menggabungkan beberapa teknologi.Misalnya, smartphone sekarang banyak digunakan sebagai perangkat analitik portabel dan memiliki potensi besar untuk integrasi LOCC.Matahari dkk.[21] membuat chip mikofluida yang memungkinkan multiplexing urutan asam nukleat spesifik dari lima patogen, termasuk SARS-CoV-2, menggunakan LAMP dan menganalisisnya menggunakan smartphone dalam waktu 1 jam setelah akhir reaksi.Sebagai contoh lain, Sundah et al.[112] menciptakan sakelar molekuler [amplifikasi katalitik oleh sakelar keadaan transisi molekuler (CATCH)] untuk deteksi langsung dan sensitif target RNA SARS-CoV-2 menggunakan ponsel cerdas. CATCH kompatibel dengan LOCC portabel dan mencapai kinerja yang unggul (sekitar 8 salinan RNA/μl; <1 jam pada suhu kamar) [112]. CATCH kompatibel dengan LOCC portabel dan mencapai kinerja yang unggul (sekitar 8 salinan RNA/μl; <1 jam pada suhu kamar) [112]. CATCH овместим ортативным LOCC обеспечивает евосходную оизводительность (примерно 8 копий /мкл; < 1 омнатной емпературе) [112]. CATCH kompatibel dengan LOCC portabel dan memberikan throughput yang sangat baik (sekitar 8 salinan RNA/µl; <1 jam pada suhu kamar) [112]. TANGKAP LOCC 8 RNA /μl；室温下< 1 [112]。 TANGKAP LOCC 8 RNA /μl；室温下< 1 [112]。 CATCH овместим ортативными LOCC обладает евосходной оизводительностью (примерно 8 опий /мкл; < 1 аса омнатной емпературе) [112]. CATCH kompatibel dengan LOCC portabel dan memiliki kinerja yang sangat baik (sekitar 8 salinan RNA/µl; <1 jam pada suhu kamar) [112].Selain itu, perangkat LOCC untuk diagnostik molekuler juga menggunakan beberapa kekuatan pendorong seperti vakum, peregangan, dan medan listrik.Kang dkk.[113] mendemonstrasikan PCR nanoplasma-on-a-chip real-time, ultra-cepat untuk diagnosis COVID-19 yang cepat dan kuantitatif di lapangan menggunakan chip PCR cair plasmonic vakum.Li dkk.[114] kemudian mengembangkan chip mikofluida yang digerakkan oleh peregangan yang memungkinkan diagnosis COVID-19.Platform menggunakan sistem amplifikasi RT-LAMP untuk menentukan apakah sampel secara kualitatif positif atau negatif.Selanjutnya, Ramachandran et al.[115] mencapai gradien medan listrik yang sesuai menggunakan isotachophoresis (ITP), teknik pemfokusan ion selektif yang diterapkan dalam mikrofluida.Dengan ITP, RNA target dari sampel swab nasofaring mentah dapat dimurnikan secara otomatis.Kemudian Ramachandran dkk.[115] Menggabungkan pemurnian ITP ini dengan uji LAMP dan CRISPR yang ditingkatkan ITP mendeteksi SARS-CoV-2 pada usap nasofaring manusia dan spesimen klinis dalam waktu sekitar 35 menit.Selain itu, ide-ide baru terus bermunculan.Jadhav dkk.[116] mengusulkan skema diagnostik berdasarkan spektroskopi Raman permukaan-ditingkatkan dalam kombinasi dengan perangkat mikofluida yang mengandung baik berorientasi vertikal emas / perak berlapis karbon nanotube atau electrospun mikro / nanotube sekali pakai.Saluran mikro filter bawaan yang difungsikan dengan membran dapat dibuang.Perangkat menyerap virus dari berbagai cairan/eksudasi tubuh seperti air liur, nasofaring dan air mata.Dengan demikian, titer virus melimpah dan virus dapat diidentifikasi secara akurat dengan tanda tangan Raman.
LOAD adalah platform mikrofluida sentrifugal di mana semua proses dikendalikan oleh protokol frekuensi yang memutar substrat berstruktur mikro [110].Perangkat LOAD dicirikan dengan menggunakan gaya sentrifugal sebagai kekuatan pendorong yang penting.Cairan juga tunduk pada gaya kapiler, Euler dan Coriolis.Menggunakan perangkat centrifuge, analisis dilakukan dalam operasi cairan terus menerus dari posisi radial ke dalam ke posisi luar, menghilangkan kebutuhan untuk tabung eksternal tambahan, pompa, aktuator, dan katup aktif.Singkatnya, metode kontrol tunggal menyederhanakan operasi.Gaya yang bekerja pada cairan dalam saluran mikrofluida yang sama pada jarak yang sama dari pusat beban adalah sama, yang memungkinkan untuk mengulangi struktur saluran.Dengan demikian, peralatan LOAD lebih sederhana dan lebih ekonomis untuk dirancang dan dibuat daripada peralatan LOCC konvensional, sementara sebagian besar reaksinya independen dan paralel;namun, karena kekuatan mekanik yang tinggi dari peralatan sentrifugal, bahan chip yang tersedia terbatas dan volume kecil sulit.ke mobil.Pada saat yang sama, sebagian besar perangkat LOAD dirancang untuk sekali pakai saja, yang mahal untuk deteksi skala besar [96, 117, 118, 119].
Dalam beberapa dekade terakhir, LOAD, dianggap sebagai salah satu perangkat mikofluida yang paling menjanjikan, telah menerima banyak perhatian dari para peneliti dan produsen.Dengan demikian, LOAD telah diterima secara luas dan telah digunakan untuk diagnostik molekuler patogen infeksius [120, 121, 122, 123, 124], terutama selama wabah COVID-19.Sebagai contoh, pada akhir tahun 2020, Ji et al.[60] mendemonstrasikan uji RT-qPCR langsung untuk deteksi paralel yang cepat dan otomatis dari infeksi SARS-CoV-2 dan influenza A dan B pada spesimen usap tenggorokan.Kemudian Xiong dkk.[74] menyajikan platform mikrofluida diskoid terintegrasi LAMP untuk deteksi cepat, akurat, dan simultan dari tujuh virus corona pernapasan manusia, termasuk SARS-CoV-2, dalam waktu 40 menit.Pada awal tahun 2021, de Oliveira dkk.[73] mendemonstrasikan chip mikrofluida sentrifugal toner polistiren, dioperasikan secara manual dengan rotator ujung jari, untuk diagnosis molekuler RT-LAMP COVID-19.Selanjutnya, Dignan et al.[39] menyajikan perangkat mikro sentrifus portabel otomatis untuk pemurnian RNA SARS-CoV-2 langsung dari bagian usap bukal.Medved dkk.[53] mengusulkan sistem pengambilan sampel aerosol SARS-CoV-2 inline dengan chip fluoresen mikrofluida berputar volume kecil dengan batas deteksi 10 salinan/μL dan ambang siklus minimum 15 menit.Suarez dkk.[75] baru-baru ini melaporkan pengembangan platform mikrofluida sentrifugal modular terintegrasi untuk deteksi langsung RNA SARS-CoV-2 dalam sampel usap nasofaring yang tidak diaktifkan dengan panas menggunakan LAMP.Contoh-contoh ini menunjukkan manfaat besar dan janji LOAD dalam diagnostik molekuler COVID-19.
Pada tahun 1945 Muller dan Clegg [125] pertama kali mempresentasikan saluran mikofluida di atas kertas menggunakan kertas saring dan parafin.Pada tahun 2007, kelompok Whitesides [126] menciptakan platform kertas fungsional pertama untuk pengujian protein dan glukosa.Kertas telah menjadi substrat yang ideal untuk mikrofluida.Kertas memiliki sifat yang melekat seperti hidrofilisitas dan struktur berpori, biokompatibilitas yang sangat baik, ringan, fleksibilitas, lipat, biaya rendah, kemudahan penggunaan dan kenyamanan.PAD klasik terdiri dari struktur hidrofilik/hidrofobik yang dibangun di atas substrat kertas.Tergantung pada struktur tiga dimensinya, PAD dapat dibagi menjadi PAD dua dimensi (2D) dan tiga dimensi (3D).PAD 2D diproduksi dengan membentuk batas hidrofobik untuk membentuk saluran mikofluida, sedangkan PAD 3D biasanya dibuat dari tumpukan lapisan kertas mikofluida 2D, terkadang dengan melipat kertas, teknik slip, saluran terbuka, dan pencetakan 3D [96].Cairan berair atau biologis pada PAD terutama dikendalikan oleh gaya kapiler tanpa sumber daya eksternal, memfasilitasi pra-penyimpanan reagen, penanganan sampel, dan deteksi multipleks.Namun, kontrol aliran yang akurat dan deteksi multipleks terhambat oleh kecepatan deteksi, sensitivitas, dan penggunaan kembali yang tidak memadai [96, 127, 128, 129, 130].
Sebagai platform mikofluida yang tidak biasa, PAD telah dipromosikan dan dikembangkan secara luas untuk diagnosis molekuler penyakit menular seperti HCV, HIV, dan SARS-CoV-2 [131, 132].Untuk deteksi HCV selektif dan sensitif, Tengam et al.[133] mengembangkan biosensor baru berdasarkan kertas fluoresen menggunakan probe asam nukleat yang sangat spesifik berdasarkan peptida pirolidinil.Asam nukleat secara kovalen diimobilisasi pada kertas selulosa teroksidasi sebagian dengan alkilasi reduktif antara gugus amino dan gugus aldehida, dan deteksi didasarkan pada fluoresensi.Sinyal ini dapat dibaca oleh gadget yang dibuat khusus dengan kamera fluorescent portabel yang dikombinasikan dengan kamera ponsel.Selanjutnya, Lu et al.[134] merancang elektroda fleksibel berbasis kertas berdasarkan komposit kerangka organologam nikel/emas/nano nano/karbon/polivinil alkohol untuk deteksi target HIV dengan hibridisasi DNA menggunakan metilen biru sebagai indikator redoks DNA.Baru-baru ini, Chowdury et al.[135] mempresentasikan desain platform hipotetis untuk pengujian PAD di tempat perawatan menggunakan air liur pasien mentah yang dikombinasikan dengan LAMP dan teknologi pencitraan portabel untuk deteksi analit COVID-19.
Tes aliran lateral memandu cairan dengan gaya kapiler dan mengontrol pergerakan cairan dengan keterbasahan dan karakteristik substrat berpori atau berstruktur mikro.Perangkat aliran lateral terdiri dari sampel, konjugat, inkubator dan deteksi, dan bantalan penyerap.Molekul asam nukleat dalam LFA mengenali pengikat spesifik yang telah disimpan sebelumnya di situs pengikatan dan mengikat sebagai kompleks.Saat cairan melewati pelat inkubasi dan deteksi, kompleks ditangkap oleh molekul penangkap yang terletak di jalur uji dan kontrol, menunjukkan hasil yang dapat dibaca langsung dengan mata telanjang.Biasanya, LFA dapat diselesaikan dalam 2-15 menit, yang lebih cepat daripada penemuan tradisional.Karena mekanisme khusus, LFA memerlukan sedikit operasi dan tidak memerlukan peralatan tambahan, yang membuatnya sangat mudah digunakan.Pembuatan dan miniaturisasinya mudah, dan biaya substrat berbasis kertas lebih rendah.Namun, ini hanya digunakan untuk analisis kualitatif, dan deteksi kuantitatif sangat sulit, dan kemampuan multiplexing dan throughput sangat terbatas, dan hanya satu asam nukleat yang cukup dapat dideteksi pada suatu waktu [96.110.127].
Meskipun sebagian besar aplikasi LFA difokuskan pada immunoassay, penggunaan LFA untuk diagnostik molekuler dalam chip mikofluida juga efektif dan populer [136].Dalam kasus virus hepatitis B, HIV dan SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] mengusulkan platform LFA nanopartikel konversi-up dan menunjukkan keserbagunaan platform mini dan portabel ini melalui deteksi sensitif dan kuantitatif beberapa target seperti asam nukleat HBV.Selain itu, Fu et al.[138] mendemonstrasikan LFA baru berdasarkan spektroskopi Raman yang ditingkatkan permukaan untuk analisis kuantitatif DNA HIV-1 pada konsentrasi rendah.Untuk deteksi cepat dan sensitif dari SARS-CoV-2, Liu et al.[85] mengembangkan analisis aliran lateral RPA terintegrasi mikrofluida dengan menggabungkan RT-RPA dan sistem deteksi aliran lateral universal ke dalam sistem mikrofluida tunggal.
Penerapan berbagai platform mikofluida bervariasi tergantung pada studi tertentu, mengambil keuntungan penuh dari kemampuan dan keunggulan platform.Dengan katup, pompa, dan saluran yang terjangkau, LOCC adalah platform paling komprehensif untuk keragaman aplikasi dan interoperabilitas dengan ruang pengembangan terbesar.Oleh karena itu, kami berharap dan merekomendasikan agar studi terbaru dilakukan di LOCC sebagai upaya pertama dan agar kondisinya lebih optimal.Selain itu, metode yang lebih efisien dan akurat diharapkan dapat ditemukan dan digunakan dalam sistem.LOAD unggul dalam kontrol cairan yang tepat dari perangkat LOCC yang ada dan menunjukkan keunggulan unik dalam drive tunggal dengan gaya sentrifugal tanpa memerlukan drive eksternal, sementara respons paralel dapat dipisahkan dan disinkronkan.Dengan demikian, di masa depan, LOAD akan menjadi platform mikofluida utama dengan lebih sedikit operasi manual dan teknologi yang lebih matang dan otomatis.Platform PAD menggabungkan manfaat LOCC dan bahan berbasis kertas untuk diagnostik sekali pakai berbiaya rendah.Oleh karena itu, pengembangan masa depan harus fokus pada teknologi yang nyaman dan mapan.Selain itu, LFA sangat cocok untuk deteksi mata telanjang, menjanjikan untuk mengurangi konsumsi sampel dan mempercepat deteksi.Perbandingan platform terperinci ditunjukkan pada Tabel 2.
Analisis digital membagi sampel menjadi banyak mikroreaktor, yang masing-masing berisi sejumlah molekul target diskrit [139, 140].Tes digital menawarkan keuntungan yang signifikan untuk melakukan kuantisasi absolut dengan melakukan ribuan percobaan biokimia paralel secara bersamaan dan individual dalam kompartemen skala mikron daripada dalam fase kontinu.Dibandingkan dengan mikrofluida tradisional, reaksi kompartemen dapat mengurangi volume sampel, meningkatkan efisiensi reaksi, dan mudah diintegrasikan dengan metode analisis lainnya tanpa memerlukan saluran, pompa, katup, dan desain yang ringkas [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Dua metode berikut digunakan dalam uji digital untuk mencapai pemisahan larutan yang seragam dan akurat, termasuk reagen dan sampel seperti sel, asam nukleat, dan partikel atau molekul lain: (1) emulsi tetes yang memanfaatkan ketidakstabilan antarmuka cairan;(2) pembagian array dilakukan oleh kendala geometris perangkat.Pada metode pertama, tetesan yang mengandung reagen dan sampel dalam saluran mikro dapat dibuat dengan metode pasif seperti arus bersama, aliran silang, pemfokusan aliran, emulsifikasi bertahap, emulsifikasi saluran mikro, dan membran melalui gaya geser kental dan emulsifikasi dengan perubahan saluran.lokalisasi [143, 145, 146, 148, 149] atau menggunakan metode aktif [150, 151], yang memperkenalkan energi tambahan melalui kontrol listrik, magnetik, termal dan mekanik.Dalam pendekatan terakhir, keseragaman volume cairan terbaik dalam ruang mikofluida dibagi dengan menjaga struktur spasial dengan ukuran yang sama, seperti micropits dan susunan permukaan [152.153.154].Khususnya, tetesan adalah bagian aliran utama yang juga dapat dihasilkan dan dimanipulasi pada susunan elektroda berdasarkan mikrofluida digital (DMF).Pembasahan elektro dielektrik adalah salah satu teori DMF yang paling baik dipelajari, karena pembasahan elektro dielektrik memungkinkan manipulasi yang tepat dari tetes individu, mengendalikan bentuk cairan dan sinyal listrik asimetris melewati sisi yang berbeda [141, 144].Operasi utama dengan droplet di DMF meliputi sortasi, pemisahan, dan penggabungan [151, 155, 156], yang dapat diterapkan di berbagai bidang analisis, terutama dalam deteksi molekuler [157, 158, 159].
Deteksi asam nukleat digital adalah teknologi diagnostik molekuler generasi ketiga setelah PCR konvensional dan PCR waktu nyata kuantitatif (qPCR), secara paralel dengan sekuensing throughput tinggi dan biopsi cair.Dalam dua dekade terakhir, asam nukleat digital telah berkembang pesat di bidang diagnostik molekuler patogen infeksius [160, 161, 162].Kuantifikasi mutlak deteksi asam nukleat digital dimulai dengan mengemas sampel dan reagen ke dalam kompartemen individu untuk memastikan bahwa setiap urutan target memiliki kemungkinan yang sama untuk memasuki setiap kompartemen individu.Secara teoritis, setiap bagian dapat diberikan beberapa urutan target, atau mungkin tidak ada sistem reaksi mikro yang independen.Melalui berbagai mekanisme penginderaan yang dijelaskan di atas, kompartemen dengan urutan target mikroba yang menghasilkan sinyal di atas ambang batas tertentu dapat divisualisasikan dengan mata telanjang atau dengan mesin dan diberi label sebagai positif, sementara kompartemen lain yang menghasilkan sinyal di bawah ambang batas diberi label sebagai positif. .yang negatif, yang membuat sinyal untuk setiap bagian menjadi boolean.Jadi, dengan menghitung jumlah kompartemen yang dibuat dan laju hasil positif setelah reaksi, salinan asli dari sampel uji dapat dicocokkan menggunakan rumus distribusi Poisson tanpa memerlukan kurva standar, yang diperlukan untuk analisis kuantitatif rutin seperti sebagai qPCR.[163] Dibandingkan dengan metode diagnostik molekuler tradisional, deteksi asam nukleat digital memiliki tingkat otomatisasi yang lebih tinggi, kecepatan dan sensitivitas analisis yang lebih tinggi, reagen yang lebih sedikit, kontaminasi yang lebih sedikit, serta desain dan pembuatan yang lebih sederhana.Untuk alasan ini, penggunaan uji digital, terutama metode berbasis tetes, untuk diagnostik molekuler, yang menggabungkan teknik amplifikasi dan pembacaan sinyal, telah dipelajari dengan baik selama wabah kritis SARS-CoV-2.Misalnya, Yin et al.[164] menggabungkan metode digital droplet dan PCR cepat untuk mendeteksi gen ORF1ab, N, dan RNase P pada SARS-CoV-2 dalam chip mikrofluida.Khususnya, sistem mampu mengidentifikasi sinyal positif dalam waktu 115 detik, yang lebih cepat daripada PCR konvensional, yang menunjukkan efektivitasnya dalam deteksi titik perawatan (Gambar 7a).Dong dkk.[165], Sow et al.[157], Chen dkk.[166] dan Alteri et al.[167] juga menerapkan droplet digital PCR (ddPCR) untuk mendeteksi SARS-CoV-2 dalam sistem mikofluida dengan hasil yang mengesankan.Untuk lebih meningkatkan tingkat deteksi, Shen et al.[168] mencapai pencitraan chip berbasis ddPCR hanya dalam waktu 15 detik tanpa menggunakan teknik jahitan gambar, mempercepat proses teknologi ddPCR dari lab ke aplikasi.Tidak hanya metode amplifikasi termal seperti PCR yang diterapkan, tetapi juga metode amplifikasi isotermal digunakan untuk menyederhanakan kondisi reaksi dan respon yang cepat.Lu dkk.[71] mengembangkan SlipChip untuk analisis tetesan, yang mampu menghasilkan tetesan berbagai ukuran pada kepadatan tinggi dalam satu langkah dan mengukur asam nukleat SARS-CoV-2 menggunakan LAMP digital (Gambar 7b).Sebagai teknologi yang berkembang pesat, CRISPR juga dapat memainkan peran penting dalam deteksi asam nukleat digital melalui pencitraan kolorimetri yang nyaman tanpa perlu pewarnaan asam nukleat tambahan.Ackerman dkk.mengembangkan reaksi matriks kombinatorial untuk evaluasi multipleks asam nukleat.[158] mendeteksi 169 virus terkait manusia, termasuk SARS-CoV-2, dalam tetesan yang mengandung reagen deteksi asam nukleat berbasis CRISPR-Cas13 dalam uji microwell (Gambar 7c).Selain itu, amplifikasi isotermal dan teknologi CRISPR dapat digunakan dalam sistem yang sama untuk menggabungkan manfaat keduanya.Taman dkk.[169] Uji digital CRISPR/Cas12a dikembangkan dalam chip mikofluida komersial untuk mendeteksi SARS-CoV-2 yang diekstraksi dan dimatikan dengan panas berdasarkan RT-RPA satu tahap dengan deteksi sinyal-ke-latar belakang yang lebih pendek dan lebih tinggi rasio waktu., rentang dinamis yang lebih luas dan sensitivitas yang lebih baik (Gbr. 7d).Beberapa deskripsi dari contoh-contoh ini diberikan pada Tabel 3.
Platform digital tipikal untuk deteksi asam nukleat.a Alur kerja PCR digital cepat terdiri dari empat langkah utama: preparasi sampel, distribusi campuran reaksi, proses amplifikasi, dan kuantifikasi target (diadaptasi dari [164]).b Skema yang menunjukkan analisis tetesan SlipChip untuk pembentukan tetesan pada kepadatan tinggi (diadaptasi dari [71]).c Diagram alur kerja CARMEN-Cas13 (diadaptasi dari [158]).d Ikhtisar deteksi virus digital tingkat lanjut dengan CRISPR/Cas dalam satu pot (diadaptasi dari [169]).Tanpa air dalam minyak, PDMS polydimethylsiloxane, reaksi berantai polimerase PCR, pengumpulan data DAQ, turunan integral proporsional PID, reaksi matriks kombinatorial CARMEN untuk evaluasi asam nukleat multipleks, SARS-CoV-2, sindrom pernapasan akut parah, coronavirus 2 , RT Amplifikasi sinyal reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, S/B di latar belakang