Berita

Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Metode pelabelan kedekatan enzimatik berdasarkan ester teraktivasi atau radikal fenoksi banyak digunakan untuk memetakan proteom subseluler dan interaktor protein dalam sel hidup.Namun, ester teraktivasi kurang reaktif, menghasilkan radius pelabelan yang lebar, dan radikal fenoksi yang dihasilkan oleh perlakuan peroksida dapat mengganggu jalur redoks.Di sini kami melaporkan metode proximity labeling dependent photoactivation (PDPL) yang dikembangkan dengan menghubungkan secara genetik protein fotosensitizer miniSOG ke protein yang diinginkan.Dipicu oleh cahaya biru dan dikendalikan oleh waktu pemaparan, oksigen singlet dihasilkan dan kemudian pelabelan residu histidin yang diselesaikan secara spatiotemporal oleh probe anilin tercapai.Kami menunjukkan kesetiaannya yang tinggi melalui pemetaan proteom khusus organel.Perbandingan berdampingan PDPL dengan TurboID menunjukkan cakupan proteomik PDPL yang lebih spesifik dan komprehensif.Selanjutnya, kami menerapkan PDPL ke koaktivator transkripsional terkait penyakit BRD4 dan E3 Parkin ligase dan menemukan interaksi yang sebelumnya tidak diketahui.Dengan penyaringan ekspresi berlebih, dua substrat yang tidak diketahui, Ssu72 dan SNW1, diidentifikasi untuk Parkin, yang degradasinya dimediasi oleh jalur ubiquitination-proteasome.
Karakterisasi akurat dari jaringan protein mendasari banyak proses seluler mendasar.Oleh karena itu, pemetaan spatiotemporal interaksi protein yang sangat akurat akan memberikan dasar molekuler untuk menguraikan jalur biologis, patologi penyakit, dan mengganggu interaksi ini untuk tujuan terapeutik.Untuk tujuan ini, metode yang mampu mendeteksi interaksi temporal dalam sel atau jaringan hidup sangat diinginkan.Spektrometri Massa Pemurnian Afinitas (AP-MS) secara historis telah digunakan untuk mengidentifikasi mitra pengikat protein yang diminati (POI).Dengan pengembangan metode proteomik kuantitatif, Bioplex3.0 telah dibuat, database jaringan protein terbesar berdasarkan AP-MS.Meskipun AP-MS sangat kuat, lisis sel dan langkah-langkah pengenceran dalam alur kerja bias terhadap interaksi pengikatan yang lemah dan sementara dan memperkenalkan artefak pasca-lisis seperti pasangan interaksi palsu yang tidak memiliki kompartementalisasi sebelum lisis.
Untuk mengatasi masalah ini, asam amino tidak alami (UAA) dengan gugus ikatan silang dan platform pelabelan dekat enzimatik (PL) (misalnya APEX dan BioID)5 telah dikembangkan.Meskipun metode UAA telah berhasil diterapkan dalam banyak skenario dan memberikan informasi tentang perekat protein langsung, optimasi situs penyisipan UAA masih diperlukan.Lebih penting lagi, ini adalah metode pelabelan stoikiometrik yang tidak memiliki pembalikan katalitik dari peristiwa pelabelan.Sebaliknya, metode PL enzimatik, seperti metode BioID, menggabungkan biotin ligase yang direkayasa menjadi POI7, yang kemudian mengaktifkan biotin untuk membentuk perantara ester biotinil-AMP reaktif.Dengan demikian, enzim mengkatalisis dan melepaskan “awan” biotin teraktivasi yang memberi label pada residu lisin proksimal.Namun, BioID membutuhkan lebih dari 12 jam untuk mendapatkan sinyal berlabel yang cukup, yang menghalangi penggunaannya dengan resolusi temporal.Menggunakan evolusi terarah berdasarkan tampilan ragi, TurboID dirancang berdasarkan BioID agar lebih efisien, memungkinkan pelabelan yang efisien dengan biotin dalam 10 menit, memungkinkan proses yang lebih dinamis untuk dipelajari.Karena TurboID sangat aktif dan tingkat biotin endogen cukup untuk pelabelan tingkat rendah, pelabelan latar belakang menjadi masalah potensial ketika pelabelan yang sangat ditingkatkan dan waktunya diperlukan dengan penambahan biotin eksogen.Selain itu, ester teraktivasi kurang reaktif (t1/2 ~5 menit), yang dapat menyebabkan radius pelabelan yang besar, terutama setelah saturasi protein tetangga dengan biotin 5. Dalam pendekatan lain, fusi genetik askorbat peroksidase yang direkayasa (yaitu biotin- radikal fenol dan memungkinkan pelabelan protein dalam satu menit9,10.APEX secara luas digunakan untuk mengidentifikasi proteom subselular, kompleks protein membran, dan kompleks protein pensinyalan sitosol.11,12 Namun, kebutuhan akan konsentrasi peroksida yang tinggi dapat mempengaruhi protein atau jalur redoks, mengganggu proses seluler.
Dengan demikian, metode baru yang mampu menghasilkan spesies penekan radius berlabel yang lebih reaktif dengan akurasi spasial dan temporal yang tinggi tanpa mengganggu jalur seluler secara signifikan akan menjadi tambahan penting untuk metode yang ada. Di antara spesies reaktif, oksigen singlet menarik perhatian kami karena masa pakainya yang singkat dan radius difusi yang terbatas (t1/2 < 0,6 s dalam sel)13. Di antara spesies reaktif, oksigen singlet menarik perhatian kami karena masa pakainya yang singkat dan radius difusi yang terbatas (t1/2 < 0,6 s dalam sel)13. еди активных орм аше ание е етный ород -за его ороткого емени ограниченного адиуса (t1/2 < 0,6 етк) Di antara bentuk aktif, oksigen singlet menarik perhatian kami karena masa pakainya yang singkat dan radius difusi yang terbatas (t1/2 < 0,6 s dalam sel)13.t1/2 < 0,6 s）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0,6 s）而引起了我们的注意13 еди активных орм аше ание екает етный ород -за его ороткого емени ограниченного адиуса (t1/2 < 0,6 ). Di antara bentuk aktif, oksigen singlet menarik perhatian kita karena masa pakainya yang singkat dan radius difusi yang terbatas (t1/2 < 0,6 s dalam sel).Oksigen singlet telah dilaporkan mengoksidasi metionin, tirosin, histidin dan triptofan secara acak, menjadikannya polar 14,15 untuk melekat pada probe berbasis amina atau tiol16,17.Meskipun oksigen singlet telah digunakan untuk memberi label RNA kompartemen subseluler, strategi untuk menggunakan kembali penanda kedekatan POI endogen masih belum dijelajahi.Di sini, kami menyajikan platform yang disebut pelabelan kedekatan yang bergantung pada fotoaktivasi (PDPL), di mana kami menggunakan cahaya biru untuk menerangi POI yang digabungkan dengan fotosensitizer miniSOG dan memicu generasi oksigen singlet untuk mengoksidasi residu proksimal, diikuti dengan modifikasi yang mengandung amina untuk mengoksidasi probe kimia menjadi sel hidup perantara..Kami menguji sekelompok probe kimia untuk memaksimalkan spesifisitas tag dan mengidentifikasi situs modifikasi menggunakan alur kerja proteomik terbuka.Perbandingan berdampingan PDPL dengan TurboID menunjukkan cakupan proteomik PDPL yang lebih spesifik dan komprehensif.Kami menerapkan pendekatan ini pada penanda spesifik organel dari proteom subseluler dan identifikasi proteom umum dari mitra pengikat untuk protein pengatur epigenetik terkait kanker BRD4 dan E3 ligase Parkin terkait penyakit Parkinson, yang mengkonfirmasi jaringan protein yang diketahui dan tidak diketahui interaksi..Kemampuan PDPL untuk mengenali substrat E3 dalam kompleks protein besar menunjukkan situasi di mana pengenalan pengikat tidak langsung diperlukan.Dua substrat parkin yang tidak diketahui yang dimediasi oleh ubiquitination-proteasome telah dikonfirmasi in situ.
Terapi fotodinamik (PDT)19 dan inaktivasi laser berbantuan kromofor (CALI)20, di mana penyinaran cahaya dengan fotosensitizer menghasilkan oksigen tunggal, dapat menonaktifkan protein target atau menyebabkan kematian sel.Karena oksigen singlet adalah zat yang sangat reaktif dengan jarak difusi teoritis sekitar 70 nm, oksidasi terbatas secara spasial di sekitar fotosensitizer dapat dikontrol.Berdasarkan konsep ini, kami memutuskan untuk menggunakan oksigen singlet untuk mencapai pelabelan kompleks protein dalam sel hidup.Kami telah mengembangkan pendekatan kemoproteomik PDPL untuk memenuhi empat fungsi: (1) untuk mengkatalisis pembentukan oksigen singlet aktif yang serupa dengan pendekatan enzimatik PL;(2) memberikan pelabelan yang diselesaikan dengan waktu pada inisiasi cahaya;(3) dengan perubahan (4) Hindari penggunaan kofaktor endogen (seperti biotin) untuk mengurangi latar belakang, atau gunakan reagen eksogen yang sangat mengganggu (seperti peroksida) untuk meminimalkan paparan sel terhadap tekanan lingkungan.
Fotosensitizer dapat dibagi menjadi dua kategori termasuk fluorofor dengan berat molekul kecil (misalnya rose bengal, methylene blue)22 dan protein kecil yang dikodekan secara genetik (misalnya miniSOG, KillerRed)23.Untuk mencapai desain modular, kami mengembangkan platform PDPL generasi pertama dengan menambahkan protein photosensitizer (PS) ke POI24,25 (Gambar 1a).Ketika disinari dengan cahaya biru, oksigen singlet mengoksidasi residu asam amino nukleofilik proksimal, menghasilkan polaritas umpolung yang elektrofilik dan selanjutnya dapat bereaksi dengan nukleofil probe amina16,17.Probe dirancang dengan pegangan alkuna untuk memungkinkan kimia klik dan tarik ke bawah untuk karakterisasi LC/MS/MS.
Ilustrasi skema pelabelan kompleks protein yang dimediasi oleh miniSOG.Saat terkena cahaya biru, sel yang mengekspresikan miniSOG-POI menghasilkan oksigen singlet, yang memodifikasi protein yang berinteraksi tetapi bukan protein yang tidak mengikat.Produk antara fotooksidasi dicegat oleh label relai dari probe kimia amina untuk membentuk aduk kovalen.Gugus alkil pada probe kimia memungkinkan kimia klik untuk pengayaan dengan pull-down diikuti oleh kuantisasi LC-MS/MS.b Struktur kimia probe amina 1-4.c Analisis gel fluoresen representatif dari penanda proteomik yang dimediasi miniSOG terlokalisasi mitokondria menggunakan probe 1-4 dan kuantifikasi relatif berdasarkan densitometri gel.Rasio sinyal-ke-latar belakang dari probe kimia dinilai menggunakan eksperimen kontrol negatif tidak termasuk cahaya biru atau menggunakan sel HEK293T tanpa ekspresi miniSOG.n = 2 sampel yang independen secara biologis.Setiap titik mewakili replika biologis.d Deteksi representatif dan kuantifikasi PDPL menggunakan probe 3 yang dioptimalkan dengan ada atau tidak adanya komponen PDPL yang ditunjukkan seperti c.n = 3 sampel yang independen secara biologis.Setiap titik mewakili replika biologis.Garis tengah dan kumis mewakili mean dan ± standar deviasi.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Pencitraan confocal oksigen singlet dengan pewarnaan Si-DMA merah jauh.Bilah skala: 10 m.Pencitraan gel dan eksperimen confocal diulang secara independen setidaknya dua kali dengan hasil yang serupa.
Kami pertama-tama menguji kemampuan fotosensitizer dewasa miniSOG26 dan KillerRed23, yang diekspresikan secara stabil dalam HEK293T, untuk memediasi pelabelan propargylamine dari proteom sebagai probe kimia (Gambar Tambahan 1a).Analisis fluoresensi gel menunjukkan bahwa pelabelan seluruh proteom dicapai dengan menggunakan miniSOG dan iradiasi cahaya biru, sementara tidak ada produk pelabelan yang terlihat dengan KillerRed.Untuk meningkatkan rasio signal-to-background, kami kemudian menguji satu set probe kimia yang mengandung anilin (1 dan 3), propilamina (2), atau benzilamina (4).Kami mengamati bahwa sel HEK293T sendiri memiliki sinyal latar belakang yang lebih tinggi dibandingkan tanpa cahaya biru, mungkin karena fotosensitizer riboflavin endogen, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Probe kimia berbasis anilin 1 dan 3 memberikan spesifisitas yang lebih baik, dengan HEK293T yang mengekspresikan miniSOG secara stabil di mitokondria menampilkan peningkatan sinyal >8 kali lipat untuk probe 3, sedangkan probe 2 yang digunakan dalam metode pelabelan RNA CAP-seq hanya menampilkan ~2,5- peningkatan sinyal lipat, kemungkinan karena preferensi reaktivitas yang berbeda antara RNA dan protein (Gbr. 1b, c). Probe kimia berbasis anilin 1 dan 3 memberikan spesifisitas yang lebih baik, dengan HEK293T yang mengekspresikan miniSOG secara stabil di mitokondria menampilkan peningkatan sinyal >8 kali lipat untuk probe 3, sedangkan probe 2 yang digunakan dalam metode pelabelan RNA CAP-seq hanya menampilkan ~2,5- peningkatan sinyal lipat, kemungkinan karena preferensi reaktivitas yang berbeda antara RNA dan protein (Gbr. 1b, c).Probe kimia berbasis anilin 1 dan 3 menunjukkan spesifisitas yang lebih baik: HEK293T, yang secara stabil mengekspresikan miniSOG dalam mitokondria, menunjukkan peningkatan lebih dari 8 kali lipat dalam sinyal untuk probe 3, sedangkan probe 2, yang digunakan dalam metode pelabelan RNA CAP-seq, hanya menunjukkan peningkatan sinyal ~2,5 kali lipat, mungkin karena preferensi reaktivitas yang berbeda antara RNA dan protein (Gbr. 1b, c).1 3 HEK293T miniSOG，探针3 > 8 RNA CAP-seq 2 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 1b，c）。的 化学 1 3 更 的 hek293t 粒体 中 minisog 探针 3 的 > 8 倍 而 于 rna cap-eq 2 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAProbe kimia berbasis anilin 1 dan 3 memiliki spesifisitas yang lebih baik, HEK293T mengekspresikan miniSOG secara stabil di mitokondria, dan probe 3 memiliki peningkatan sinyal lebih dari 8 kali lipat, sedangkan probe 2 untuk metode pelabelan RNA CAP-seq hanya menunjukkan peningkatan ~ 2,5 kali lipat.dalam sinyal, mungkin karena preferensi reaksi yang berbeda antara RNA dan protein (Gbr. 1b, c).Selain itu, probe 3 isomer dan probe hidrazin (probe 5, 6, 7) diuji, mengkonfirmasikan optimasi probe 3 (Gambar Tambahan 1b,c).Demikian pula, analisis fluoresensi dalam gel mengungkapkan parameter eksperimental lain yang dioptimalkan: panjang gelombang iradiasi (460 nm), konsentrasi probe kimia (1 mM), dan waktu iradiasi (20 menit) (Gambar Tambahan 2a-c).Menghilangkan komponen atau langkah apa pun dalam protokol PDPL menghasilkan pembalikan sinyal yang signifikan ke latar belakang (Gbr. 1d).Khususnya, pelabelan protein berkurang secara signifikan dengan adanya natrium azida atau troloks, yang diketahui dapat memadamkan oksigen singlet.Kehadiran D2O, yang diketahui menstabilkan oksigen singlet, meningkatkan sinyal pelabelan.Untuk menyelidiki kontribusi spesies oksigen reaktif lainnya untuk pelabelan, manitol dan vitamin C ditambahkan untuk membangun pemulung radikal hidroksil dan superoksida, masing-masing, 18, 29, tetapi mereka tidak ditemukan untuk mengurangi pelabelan.Penambahan H2O2, tetapi bukan penerangan, tidak menghasilkan pelabelan (Gambar Tambahan 3a).Pencitraan oksigen singlet fluoresensi dengan probe Si-DMA mengkonfirmasi keberadaan oksigen singlet dalam kabel HEK293T-miniSOG, tetapi tidak pada kabel HEK293T asli.Selain itu, mitoSOX Red tidak dapat mendeteksi produksi superoksida setelah penerangan (Gambar 1e dan Gambar Tambahan 3b) 30. Data ini sangat menyarankan bahwa oksigen tunggal adalah spesies oksigen reaktif utama yang bertanggung jawab untuk pelabelan proteomik berikutnya.Sitotoksisitas PDPL dinilai termasuk iradiasi cahaya biru dan pemeriksaan kimia, dan tidak ada sitotoksisitas signifikan yang diamati (Gambar Tambahan 4a).
Untuk mempelajari mekanisme pelabelan dan memungkinkan identifikasi proteomik kompleks protein menggunakan LC-MS/MS, pertama-tama kita perlu menentukan asam amino mana yang dimodifikasi dan massa delta label probe.Metionin, histidin, triptofan dan tirosin telah dilaporkan dimodifikasi oleh singlet oxygen14,15.Kami mengintegrasikan alur kerja TOP-ABPP31 dengan pencarian terbuka yang tidak memihak yang disediakan oleh platform komputasi FragPipe berdasarkan MSFragger32.Setelah modifikasi oksigen singlet dan pelabelan probe kimia, kimia klik dilakukan menggunakan label reduksi biotin yang mengandung penghubung yang dapat dibelah, diikuti oleh peregangan neutravidin dan pencernaan tripsin.Peptida yang dimodifikasi, masih terikat pada resin, difoto untuk analisis LC-MS/MS (Gambar 2a dan Data Tambahan 1).Sejumlah besar modifikasi terjadi di seluruh proteome dengan lebih dari 50 kecocokan peta peptida (PSM) terdaftar (Gbr. 2b).Anehnya, kami hanya mengamati modifikasi histidin, mungkin karena reaktivitas histidin teroksidasi yang lebih tinggi terhadap probe anilin daripada asam amino lainnya.Menurut mekanisme oksidasi histidin yang dipublikasikan oleh oksigen singlet,21,33 struktur massa delta yang diusulkan dari +229 Da sesuai dengan adduksi probe 3 dengan 2-okso-histidin setelah dua oksidasi, sedangkan +247 Da adalah produk hidrolisis dari +229 Da (Gambar Tambahan 5).Evaluasi spektrum MS2 menunjukkan keandalan yang tinggi dari identifikasi sebagian besar ion y dan b, termasuk identifikasi ion fragmen termodifikasi (y dan b) (Gbr. 2c).Analisis konteks dari urutan lokal histidin termodifikasi PDPL mengungkapkan preferensi motif moderat untuk residu hidrofobik kecil pada posisi ± 1 (Gambar Tambahan 4b).Rata-rata, 1,4 histidin diidentifikasi per protein, dan lokasi penanda ini ditentukan oleh analisis luas permukaan yang dapat diakses pelarut (SASA) dan ketersediaan pelarut relatif (RSA) (Gambar Tambahan 4c,d).
Alur kerja yang tidak bias untuk mempelajari selektivitas residual menggunakan platform komputasi FragPipe yang didukung oleh MSFragger.Linker yang dapat dibelah digunakan dalam kimia Click untuk memungkinkan fotocleavage peptida yang dimodifikasi dari resin streptavidin.Pencarian terbuka diluncurkan untuk mengidentifikasi berbagai modifikasi, serta sisa-sisa yang relevan.b Tetapkan massa modifikasi yang terjadi di seluruh proteom.PSM pemetaan peptida.c Anotasi spektral MS2 dari situs histidin yang dimodifikasi dengan probe 3. Sebagai contoh yang representatif, reaksi kovalen dengan probe 3 menambahkan +229,0938 Da ke asam amino yang dimodifikasi.d Uji mutasi digunakan untuk menguji penanda PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) dan PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ditransfeksi dengan plasmid tipe liar untuk deteksi anti-Bendera.e Peptida sintetik direaksikan dengan miniSOG yang dimurnikan dengan adanya probe 3 dan produk yang sesuai dengan m +247 dan +229 dicatat dalam spektrum LC-MS.f Interaksi protein-ke-protein in vitro dimodelkan dengan miniSOG-6xHis-tag dan antibodi anti-6xHis.Analisis antibiotin (streptavidin-HRP) dan anti-tikus Western blot dari kompleks antibodi miniSOG-6xHis/anti-6xHis berlabel probe 3, tergantung pada waktu paparan cahaya.Label untuk protein individu dinyatakan dalam berat molekul yang sesuai: rantai ringan antibodi LC, rantai berat antibodi HC.Eksperimen ini secara independen diulang setidaknya dua kali dengan hasil yang sama.
Untuk verifikasi biokimia dari situs pelabelan, PRDX3 dan PRDX1 yang diidentifikasi dengan spektrometri massa diubah dari histidin menjadi alanin dan dibandingkan dengan uji transfeksi tipe liar.Hasil PDPL menunjukkan bahwa mutasi secara signifikan mengurangi pelabelan (Gbr. 2d).Sementara itu, sekuens peptida yang diidentifikasi dalam pencarian terbuka disintesis dan direaksikan secara in vitro dengan miniSOG yang dimurnikan dengan adanya probe 3 dan cahaya biru, menghasilkan produk dengan pergeseran massa +247 dan +229 Da ketika dideteksi oleh LC-MS (Gbr. .2e).).Untuk menguji apakah protein proksimal yang berinteraksi dapat diberi label in vitro sebagai respons terhadap fotoaktivasi miniSOG, kami merancang uji kedekatan buatan dengan interaksi antara protein miniSOG-6xHis dan antibodi monoklonal anti-His secara in vitro (Gambar 2f).Dalam pengujian ini, kami mengharapkan pelabelan proksimal rantai berat dan ringan antibodi dengan miniSOG.Faktanya, anti-tikus (mengenali rantai berat dan ringan dari antibodi berlabel anti-6xHis) dan streptavidin Western blots menunjukkan biotinilasi yang kuat dari rantai berat dan ringan.Khususnya, kami melihat autobiotinilasi miniSOG karena tag 6xHis dan tautan silang antara rantai ringan dan berat, yang mungkin terkait dengan kesenjangan yang dijelaskan sebelumnya antara respons proksimal lisin dan 2-okso-histidin.Sebagai kesimpulan, kami menyimpulkan bahwa PDPL memodifikasi histidin dengan cara yang bergantung pada kedekatan.
Tujuan kami selanjutnya adalah mengkarakterisasi proteom subseluler untuk menguji kekhususan pelabelan in situ.Oleh karena itu, kami secara stabil mengekspresikan miniSOG dalam nukleus, matriks mitokondria, atau membran ER luar sel HEK293T (Gbr. 3a).Analisis fluoresensi gel mengungkapkan pita berlabel berlimpah di tiga lokasi subseluler serta pola pelabelan yang berbeda (Gbr. 3b).Analisis pencitraan fluoresensi menunjukkan spesifisitas PDPL yang tinggi (Gbr. 3c).Alur kerja PDPL diikuti oleh reaksi klik dengan pewarna rhodamin untuk menggambarkan proteom subseluler menggunakan mikroskop fluoresensi, dan sinyal PDPL dilokalisasi dengan DAPI, pelacak mitokondria, atau pelacak ER, yang mengonfirmasi kesetiaan tinggi PDPL.Untuk tiga lokasi organel, perbandingan berdampingan PDPL dengan TurboID menggunakan avidin western blot menunjukkan bahwa PDPL diberi label lebih spesifik dibandingkan dengan kontrolnya masing-masing.Di bawah kondisi PDPL, lebih banyak pita berlabel muncul, menunjukkan lebih banyak protein berlabel PDPL (Gambar Tambahan 6a-d).
representasi skema pelabelan proteom spesifik organel yang dimediasi miniSOG.miniSOG menargetkan matriks mitokondria melalui fusi ke N-terminal 23 asam amino COX4 manusia (mito-miniSOG), nukleus melalui fusi ke H2B (nucleus-miniSOG), dan Sec61β melalui sisi sitoplasma membran ER (ER-miniSOG ).Indikasi termasuk pencitraan gel, pencitraan confocal, dan spektrometri massa.b Gambar gel representatif dari tiga profil PDPL spesifik organel.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Gambar confocal representatif dari sel HEK293T mengekspresikan miniSOG secara stabil dengan lokalisasi subseluler berbeda yang dideteksi oleh antibodi berlabel V5 (merah).Penanda subseluler digunakan untuk mitokondria dan ER (hijau).Alur kerja PDPL mencakup deteksi proteom subseluler berlabel miniSOG (kuning) menggunakan kimia klik Cy3-azide.Bilah skala: 10 m.d Plot vulkanik dari proteom yang ditandai PDPL di berbagai organel yang diukur dengan kuantifikasi tidak berlabel (n = 3 percobaan biologis independen).Uji-t Student dua sisi digunakan pada plot gunung berapi.Jenis liar HEK293T digunakan sebagai kontrol negatif. Protein yang berubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion). Protein yang berubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion). ачительно ененные елки елены асным етом (p < 0,05 >2-кратная азница енсивности онов). Protein yang diubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion).p < 0,05 > 2p < 0,05和> 2 ачительно ененные елки елены асным цветом (p < 0,05 > 2-кратная азница онной е). Protein yang diubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan> perbedaan kekuatan ionik 2 kali lipat).Protein terkait yang penting untuk HEK293T-miniSOG tetapi tidak penting untuk HEK293T ditampilkan dalam warna hijau.e Analisis kekhususan dataset proteomik dari eksperimen d.Jumlah total protein yang signifikan secara statistik di setiap organel (titik merah dan hijau) ditandai di bagian atas.Histogram menunjukkan protein terlokalisasi dalam organel berdasarkan MitoCarta 3.0, analisis GO dan A. Ting et al.rakyat.Pisahkan kumpulan data untuk mitokondria, inti, dan ER.Eksperimen ini secara independen diulang setidaknya dua kali dengan hasil yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Didorong oleh gel dan hasil pencitraan, kuantifikasi bebas label digunakan untuk mengukur proteom yang diidentifikasi di setiap organel (Data Tambahan 2).HEK293T yang tidak ditransfeksi digunakan sebagai kontrol negatif untuk mengurangi penanda latar belakang. Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein yang diperkaya secara signifikan (p <0,05 dan intensitas ion >2 kali lipat) serta protein tunggal yang hanya ada dalam garis ekspresi miniSOG (Gbr. 3d titik merah dan hijau). Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein yang diperkaya secara signifikan (p <0,05 dan intensitas ion >2 kali lipat) serta protein tunggal yang hanya ada dalam garis ekspresi miniSOG (Gbr. 3d titik merah dan hijau). а афика ана оказал ачительно обогащенные елки (p <0, 05 > 2-кратная енсивность онов), а акже одиночные ет, отое). Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein yang diperkaya secara signifikan (p<0,05 dan intensitas ion >2 kali lipat) serta protein tunggal yang hanya ada dalam garis pengekspresian miniSOG (Gbr. 3d, titik merah dan hijau).p < 0,05 >2 miniSOG 3d分析 显示 的 p <0,05 和> 2 倍 存 minisog 系 的 单一 3d 3 афика ана ачительно обогащенные елки (p <0, 05 > 2x онная а), а акже отдельные елки, е олько в еоеSOой). Analisis plot gunung berapi mengungkapkan protein yang diperkaya secara signifikan (p<0,05 dan >2x kekuatan ionik) serta protein tunggal yang hanya ada dalam garis ekspresi miniSOG (titik merah dan hijau pada Gambar 3d).Menggabungkan data ini, kami mengidentifikasi masing-masing 1364, 461, dan 911 protein membran luar nuklir, mitokondria, dan ER yang signifikan secara statistik.Untuk menganalisis akurasi PDPL terlokalisasi organel, kami menggunakan analisis MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), dan A. Ting et al.kumpulan data8 digunakan untuk mitokondria, nukleus, dan ER untuk menguji spesifisitas organel dari protein yang terdeteksi, sesuai dengan akurasi 73,4, 78,5, dan 73,0% (Gbr. 3e).Spesifisitas PDPL menegaskan bahwa PDPL adalah alat yang ideal untuk mengidentifikasi proteom spesifik organel.Khususnya, analisis submitochondrial dari protein mitokondria yang diidentifikasi menunjukkan bahwa proteome yang terperangkap terutama didistribusikan dalam matriks dan membran dalam (masing-masing 226 dan 106), terhitung 91,7% (362) dari jumlah total protein mitokondria yang diidentifikasi.tingkat PDPL yang tinggi juga dikonfirmasi (Gambar Tambahan 7a).Demikian pula, analisis subnuklear menunjukkan bahwa proteom yang ditangkap sebagian besar didistribusikan dalam nukleus, nukleoplasma, dan nukleolus (Gambar Tambahan 7b).Analisis proteomik nuklir dengan peptida sinyal lokalisasi nuklir (3xNLS) menunjukkan akurasi yang serupa dengan konstruksi H2B (Gambar Tambahan 7c-h).Untuk menentukan spesifisitas penanda PDPL, laminin A nuklir dipilih sebagai perangkap POI7 yang lebih terlokalisasi.PDPL mengidentifikasi 36 protein yang diperkaya secara signifikan, di mana 12 protein (30,0% termasuk lamin A) adalah protein interaksi lamin A yang ditandai dengan baik yang dijelaskan oleh database String, dengan persentase yang lebih tinggi daripada metode BioID (122 protein) 28 dari 28. , 22,9 %) 7. Metode kami mengidentifikasi lebih sedikit protein, mungkin karena area pelabelan yang terbatas, yang dimungkinkan oleh oksigen singlet yang lebih aktif.Analisis GO menunjukkan bahwa protein yang diidentifikasi terutama terletak di nukleoplasma (26), membran inti (10), membran inti (9), dan pori-pori inti (5).Secara kolektif, protein terlokalisasi nuklir ini menyumbang 80% dari protein yang diperkaya, yang selanjutnya menunjukkan spesifisitas PDPL (Gambar Tambahan 8a-d).
Setelah menetapkan kemampuan PDPL untuk melakukan penandaan kedekatan pada organel, kami kemudian menguji apakah PDPL dapat digunakan untuk menganalisis mitra pengikat POI.Secara khusus, kami berusaha untuk mendefinisikan analisis PDPL dari protein sitosol, yang dianggap sebagai target yang lebih sulit daripada rekan-rekan mereka yang terlokalisasi membran karena sifatnya yang sangat dinamis.Bromodomain dan protein ekstraterminal (BET) BRD4 telah menarik perhatian kami karena peran kuncinya dalam berbagai penyakit 35, 36 .Kompleks yang dibentuk oleh BRD4 adalah koaktivator transkripsional dan target terapi yang penting.Dengan mengatur ekspresi faktor transkripsi c-myc dan Wnt5a, BRD4 dianggap sebagai penentu utama leukemia myeloid akut (AML), multiple myeloma, limfoma Burkitt, kanker usus besar dan penyakit inflamasi37,38.Selain itu, beberapa virus menargetkan BRD4 untuk mengatur transkripsi virus dan seluler, seperti papillomavirus, HIV, dan SARS-CoV-236,39.
Untuk memetakan interaksi BRD4 menggunakan PDPL, kami menggabungkan miniSOG dengan isoform terminal-N atau C-pendek dari BRD4.Hasil proteomik mengungkapkan tingkat tumpang tindih yang tinggi antara dua konstruksi (Gambar Tambahan 9a).Proteom nuklir yang diidentifikasi dengan miniSOG-H2B mencakup 77,6% protein yang berinteraksi dengan BRD4 (Gambar Tambahan 9b).Kemudian, waktu iluminasi yang berbeda (2, 5, 10, 20 menit) digunakan untuk menyesuaikan radius penanda (Gbr. 4a dan data tambahan 3).Kami menyimpulkan bahwa pada fotoperiode yang lebih pendek, PDPL terutama akan melabeli mitra pengikatan langsung, sementara periode yang lebih lama akan mencakup protein yang diidentifikasi selama periode fotoaktivasi yang lebih pendek serta target tidak langsung dalam kompleks pelabelan.Faktanya, kami menemukan tumpang tindih yang kuat antara titik waktu yang berdekatan (84,6% selama 2 dan 5 menit; 87,7% selama 5 dan 10 menit; 98,7% selama 10 dan 20 menit) (Gbr. 4b dan Gambar Tambahan 9c).Di semua kelompok eksperimen, kami tidak hanya menemukan pelabelan mandiri BRD4, tetapi beberapa target yang diketahui seperti MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, dan HMGB1 yang dijelaskan dalam database string.Kekuatan ionik dari target ini sebanding dengan waktu pemaparan (Gbr. 4c dan Gambar Tambahan 9d).Analisis GO dari protein yang diidentifikasi dalam kelompok 2 menit menunjukkan bahwa protein yang diidentifikasi terlokalisasi dalam nukleus dan terlibat dalam remodeling kromatin dan fungsi RNA polimerase.Fungsi molekuler protein diperkaya dalam pengikatan kromatin atau koaktivasi transkripsi, konsisten dengan fungsi BRD4 (Gbr. 4d).Analisis interaksi protein yang diaktifkan database string mengungkapkan tingkat pertama interaksi tidak langsung antara kompleks interaksi keluarga BRD4 dan HDAC seperti SIN3A, NCOR2, BCOR, dan SAP130 (Gbr. 4e dan Gambar Tambahan 9e), konsisten dengan BRD4 dan HDAC mengikat histon asetat ..Selain itu, target representatif yang diidentifikasi oleh LC-MS/MS, termasuk Sin3A, NSUN2, Fus, dan SFPQ, dikonfirmasi oleh Western blotting (Gbr. 4f).Baru-baru ini, isoform pendek BRD4 telah dilaporkan membentuk inti dengan sifat pemisahan fase cair-cair (LLPS).Protein pengikat RNA Fus dan SFPQ memediasi LLPS dari berbagai proses seluler dan telah diidentifikasi di sini sebagai protein pengikat BRD4 yang tidak tercatat.Interaksi antara BRD4 dan SFPQ dikonfirmasi oleh eksperimen co-imunopresipitasi (co-IP) (Gambar 4g), menunjukkan mekanisme lain untuk pemisahan fase cair-cair yang dimediasi BRD4 yang layak diselidiki lebih lanjut.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa PDPL adalah platform yang ideal untuk mengidentifikasi interaksi BRD4 yang diketahui serta protein pengikat yang tidak diketahui.
a Representasi skema penandaan kedekatan BRD4 yang dimediasi miniSOG, waktu pemaparan: 2, 5, 10, dan 20 menit.b Tumpang tindih protein diidentifikasi pada waktu iluminasi yang berbeda.Pengayaan protein yang diidentifikasi dalam HEK293T-miniSOG-BRD4 signifikan secara statistik dibandingkan dengan HEK293T tipe liar.c Intensitas ion ketika mengukur protein pengikat BRD4 yang tidak berlabel representatif yang diketahui selama waktu pemaparan yang ditentukan.n = 3 sampel yang independen secara biologis.Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi.d Analisis ontologis gen (GO) protein yang diidentifikasi dalam kelompok 2 menit.Sepuluh istilah GO pertama terdaftar.Gelembung diwarnai sesuai dengan kategori istilah GO, dan ukuran gelembung sebanding dengan jumlah protein yang ditemukan di setiap istilah.e Analisis string dari protein yang berinteraksi dengan BRD4.Lingkaran kuning adalah lem langsung dan lingkaran abu-abu adalah lapisan pertama lem tidak langsung.Garis merah mewakili interaksi yang ditentukan secara eksperimental dan garis biru mewakili interaksi yang diprediksi.f Target pengikatan BRD4 representatif yang diidentifikasi dalam LC-MS/MS diverifikasi oleh Western blotting.g Eksperimen co-imunopresipitasi mengkonfirmasi interaksi antara SFPQ dan BRD4.Eksperimen ini secara independen diulang setidaknya dua kali dengan hasil yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Selain mengidentifikasi target terkait POI yang tidak terdaftar, kami berhipotesis bahwa PDPL akan cocok untuk mengidentifikasi substrat untuk enzim, yang akan memerlukan karakterisasi protein pengikat tidak langsung dalam kompleks besar untuk membubuhi keterangan substrat yang tidak terdaftar.Parkin (dikodekan oleh PARK2) adalah ligase E3 dan mutasi pada parkin diketahui menyebabkan penyakit Parkinson remaja autosomal resesif (AR-JP)42.Selain itu, parkin telah digambarkan sebagai penting untuk mitofag (autophagy mitokondria) dan penghapusan spesies oksigen reaktif.Namun, meskipun beberapa substrat parkin telah diidentifikasi, peran parkin pada penyakit ini masih belum jelas.Untuk membubuhi keterangan pada substratnya yang tidak berkarakter, PDPL diuji dengan menambahkan miniSOG ke terminal-N atau C-parkin.Sel diperlakukan dengan transporter proton karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone (CCCP) untuk mengaktifkan parkin melalui jalur PINK1-Parkin.Dibandingkan dengan hasil BRD4 PDPL kami, fusi parkin N-terminus mengungkapkan set protein target yang lebih besar, meskipun mencakup sebagian besar C-terminus (177 dari 210) (Gambar 5a,b dan Data Tambahan 4).hasilnya konsisten dengan laporan bahwa tag N-terminal dapat mengaktifkan Parkin44 secara tidak wajar.Anehnya, hanya ada 18 protein yang tumpang tindih dalam data kami dengan hasil AP-MS yang dipublikasikan untuk Parkin43, kemungkinan karena perbedaan antara garis sel dan alur kerja proteomik.Selain empat protein yang diketahui (ARDM1, HSPA8, PSMD14, dan PSMC3) yang diidentifikasi dengan dua metode (Gbr. 5c)43.Untuk lebih memvalidasi hasil LC-MS/MS, pengobatan PDPL dan Western blotting selanjutnya digunakan untuk membandingkan hasil uji sel induk HEK293T dan jalur parkin terminal-N yang stabil.Target yang sebelumnya tidak diketahui CDK2, DUT, CTBP1, dan PSMC4 diuji dengan pengikat yang diketahui, DNAJB1 (Gbr. 5d).
Plot gunung berapi dari protein yang berinteraksi dengan parkin dalam sel HEK293T dengan miniSOG yang diekspresikan secara stabil menyatu dengan terminal-N atau C-parkin (n = 3 percobaan biologis independen).Uji-t Student dua sisi digunakan pada plot gunung berapi.HEK293T digunakan sebagai kontrol negatif. Protein yang berubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion). Protein yang berubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion). ачительно ененные елки елены асным етом (p < 0,05 >2-кратная азница енсивности онов). Protein yang diubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan >2 kali lipat perbedaan intensitas ion).p < 0,05 > 2p < 0,05和> 2 ачительно ененные елки елены асным цветом (p < 0,05 > 2-кратная азница онной е). Protein yang diubah secara signifikan disorot dalam warna merah (p <0,05 dan> perbedaan kekuatan ionik 2 kali lipat).Protein terkait yang penting untuk HEK293T-miniSOG tetapi tidak penting untuk HEK293T ditampilkan dalam warna hijau.b Diagram Venn menunjukkan protein yang tumpang tindih antara konstruksi terminal-N dan terminal-C.Tag N-terminal dapat mengaktifkan parkin secara tidak wajar dan menghasilkan protein yang lebih mudah dikenali.c Diagram Venn menunjukkan protein yang tumpang tindih antara PDPL dan AP-MS.Interaksi yang dikenal terdaftar, termasuk 4 dari 18 protein yang tumpang tindih dan 11 dari 159 protein yang secara khusus diidentifikasi dalam PDPL.d Target representatif yang diidentifikasi oleh LC-MS/MS diverifikasi oleh Western blotting.e Ssu72 dan SNW1 diidentifikasi sebagai substrat parkin yang tidak terdaftar.Plasmid protein bertanda FLAG ini ditransfusikan ke HEK293T dan HEK293T-Parkin-miniSOG diikuti oleh pengobatan CCCP pada berbagai titik waktu.Degradasi lebih jelas pada garis overekspresi Parkin.f Menggunakan proteasome inhibitor MG132, dipastikan bahwa proses degradasi Ssu72 dan SNW1 dimediasi oleh proteasome-ubiquitination.Eksperimen ini secara independen diulang setidaknya dua kali dengan hasil yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Khususnya, protein yang diidentifikasi oleh PDPL harus menyertakan protein pengikat parkin dan substratnya.Untuk mendeteksi substrat parkin yang tidak terdaftar, kami memilih tujuh protein yang diidentifikasi (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 dan SNW1) dan plasmid yang ditransfusikan untuk mengekspos gen-gen ini ke HEK293T normal dan secara stabil mengekspresikan HEK293T miniSOG-Parkin diikuti dengan pengobatan CCCP.Tingkat protein Ssu72 dan SNW1 berkurang secara signifikan pada garis miniSOG-Parkin yang stabil (Gbr. 5e).Perlakuan dengan CCCP selama 12 jam menghasilkan degradasi yang paling signifikan dari kedua substrat.Untuk menyelidiki apakah degradasi Ssu72 dan SNW1 diatur oleh proteasome-ubiquitination, inhibitor proteasome MG132 ditambahkan untuk menghambat aktivitas proteasome, dan pada kenyataannya kami menemukan bahwa proses degradasinya dihambat (Gbr. 5f).Target non-substrat tambahan dikonfirmasi sebagai interaktor Parkin menggunakan Western blotting (Gambar Tambahan 10), yang menunjukkan hasil yang konsisten dengan LC-MS/MS.Kesimpulannya, integrasi alur kerja PDPL dengan verifikasi transfeksi protein target memungkinkan identifikasi substrat ligase E3 yang tidak terdaftar.
Kami telah mengembangkan platform penandaan kedekatan umum yang memungkinkan Anda mengidentifikasi POI yang berinteraksi dalam ruang dan waktu.Platform ini didasarkan pada protein fotosensitizer miniSOG, yang hanya sekitar 12 kDa, kurang dari setengah ukuran enzim APEX2 matang (27 kDa) dan sepertiga ukuran TurboID (35 kDa).Ukuran yang lebih kecil akan sangat memperluas jangkauan aplikasi untuk mempelajari interaksi protein kecil.Eksplorasi lebih lanjut dari fotosensitizer tambahan, apakah protein yang dikodekan secara genetik atau molekul kecil, diperlukan untuk meningkatkan hasil kuantum oksigen singlet dan memperluas sensitivitas pendekatan ini.Untuk versi miniSOG saat ini, resolusi temporal tinggi dapat dicapai dengan menggunakan iluminasi biru untuk mengaktifkan penanda kedekatan.Selain itu, waktu pemaparan yang lebih lama melepaskan "awan" oksigen singlet yang lebih besar, menghasilkan modifikasi residu histidin yang lebih distal, peningkatan radius pelabelan, dan kemampuan untuk menyempurnakan resolusi spasial PDPL.Kami juga menguji tujuh probe kimia untuk meningkatkan rasio signal-to-background dan mengeksplorasi mekanisme molekuler di balik pendekatan ini.Alur kerja TOP-ABPP yang dikombinasikan dengan pencarian terbuka yang tidak bias mengkonfirmasi bahwa modifikasi hanya terjadi pada histidin dan tidak ada lingkungan mikro yang konsisten yang diamati untuk peningkatan modifikasi histidin, kecuali untuk preferensi moderat untuk histidin di wilayah loop.
PDPL juga telah digunakan untuk mengkarakterisasi proteom subseluler dengan spesifisitas dan cakupan proteom setidaknya sebanding dengan pelabelan kedekatan lainnya dan metode pemeriksaan kimia spesifik organel.Penanda kedekatan juga telah berhasil digunakan untuk mengkarakterisasi permukaan, lisosom, dan proteom terkait sekretom46,47.Kami percaya bahwa PDPL akan kompatibel dengan organel subseluler ini.Selain itu, kami menantang PDPL dengan mengidentifikasi target untuk pengikatan protein sitosol yang lebih kompleks daripada protein terikat membran karena sifat dinamisnya dan keterlibatan dalam interaksi yang lebih temporal.PDPL diaplikasikan pada dua protein, koaktivator transkripsi BRD4 dan ligase E3 Parkin terkait penyakit.Kedua protein ini dipilih tidak hanya karena fungsi biologis dasarnya, tetapi juga karena relevansi klinis dan potensi terapeutiknya.Untuk dua POI ini, mitra pengikat yang terkenal serta target yang tidak terdaftar telah diidentifikasi.Khususnya, protein SFPQ terkait pemisahan fase dikonfirmasi oleh co-IP, yang dapat menunjukkan mekanisme baru di mana BRD4 (isoform pendek) mengatur LLPS.Pada saat yang sama, kami percaya bahwa identifikasi substrat Parkin adalah skenario di mana identifikasi perekat tidak langsung diperlukan.Kami mengidentifikasi dua substrat parkin yang tidak teridentifikasi dan mengkonfirmasi degradasinya di sepanjang jalur ubiquitination-proteasome.Baru-baru ini, strategi perangkap berbasis mekanisme telah dikembangkan untuk mendeteksi substrat hidrolase dengan menjebaknya dengan enzim.Meskipun ini adalah metode yang sangat kuat, tidak cocok untuk analisis substrat yang terlibat dalam pembentukan kompleks besar dan membutuhkan pembentukan ikatan kovalen antara enzim dan substrat.Kami berharap PDPL dapat diperluas untuk mempelajari kompleks protein dan keluarga enzim lainnya, seperti keluarga deubiquitinase dan metalloprotease.
Bentuk baru miniSOG, yang disebut SOPP3, telah dikembangkan dengan peningkatan produksi oksigen singlet.Kami membandingkan miniSOG dengan SOPP3 dan menemukan peningkatan kinerja penandaan, meskipun rasio signal-to-noise tetap tidak berubah (Gambar Tambahan 11).Kami berhipotesis bahwa optimasi SOPP3 (misalnya, melalui evolusi terarah) akan menghasilkan protein fotosensitizer yang lebih efisien yang membutuhkan waktu cahaya yang lebih pendek dan dengan demikian memungkinkan proses seluler yang lebih dinamis untuk ditangkap.Khususnya, versi PDPL saat ini terbatas pada lingkungan seluler karena memerlukan penerangan cahaya biru dan tidak dapat menembus jaringan dalam.Fitur ini menghalangi penggunaannya dalam studi model hewan.Namun, kombinasi optogenetika dengan PDPL dapat memberikan peluang untuk penelitian pada hewan, terutama di otak.Selain itu, fotosensitizer inframerah rekayasa lainnya juga menghilangkan batasan ini.Penelitian saat ini sedang berlangsung di daerah ini.
Garis sel HEK293T diperoleh dari ATCC (CRL-3216).Garis sel diuji negatif untuk infeksi mikoplasma dan dikultur dalam DMEM (Thermo, #C11995500BT) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS, Vistech, #SE100-B) dan 1% penisilin/streptomisin (Hyclone, #SV30010).tumbuh di.
3-Aminofenilena (sampel 3) dan (4-etinilfenil)metanamina (sampel 4) dibeli dari Bidepharm.Propylamine (probe 2) dibeli dari Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamid (probe 1) disintesis menurut metode yang diterbitkan.
Tabel Tambahan 1 mencantumkan konstruksi genetik yang digunakan dalam penelitian ini.Urutan miniSOG dan KillerRed dikloning dari plasmid hadiah dari P. Zou (Universitas Peking).Urutan penargetan matriks mitokondria berasal dari 23 asam amino terminal-N COX4 dan dikloning ke dalam vektor yang ditunjukkan menggunakan rakitan Gibson (Beyotime, # D7010S).Untuk menargetkan membran dan inti retikulum endoplasma, DNA manusia SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) diamplifikasi oleh PCR dari perpustakaan cDNA sel HEK293T, dan DNA H2B (disumbangkan oleh D. Lin, Laboratorium Teluk Shenzhen) dan kloning , seperti yang disebutkan di atas.Kecuali dinyatakan lain, gen protein lain yang digunakan untuk transfeksi dan konstruksi garis sel yang stabil adalah PCR yang diamplifikasi dari perpustakaan cDNA sel HEK293T.G3S (GGGS) dan G4S (GGGGGS) digunakan sebagai penghubung antara protein umpan dan miniSOG.Tag epitop V5 (GKPIPNPLLGLDST) telah ditambahkan ke konstruksi fusi ini.Untuk ekspresi pada mamalia dan untuk membangun garis sel yang stabil, konstruksi fusi miniSOG disubklon ke dalam vektor lentiviral pLX304.Untuk ekspresi bakteri, miniSOG diklon ke vektor pET21a berlabel 6xHis di C-terminus.
Sel HEK293T diunggulkan pada 2,0 x 105 sel per sumur dalam pelat enam sumur dan ditransfeksi 24 jam kemudian dengan plasmid lentiviral rekombinan (2,4 g pLX304) dan plasmid kemasan virus (1,5 g psPAX2 dan 1,2 g pMD2.G) dengan menggunakan Lipo8000 (Beyotime , #C0533), sekitar 80% fusi.Setelah transfeksi semalam, media diubah dan diinkubasi selama 24 jam.Pengumpulan virus dilakukan setelah 24, 48 dan 72 jam.Sebelum infeksi garis sel target, media virus disaring melalui filter 0,8 m (Merck, #millex-GP) dan polibre (Solarbio, #H8761) ditambahkan ke konsentrasi 8 g/ml.Setelah 24 jam, sel dibiarkan pulih dengan mengganti media.Sel dipilih menggunakan blasticidin 5 g/ml (Solarbio, #3513-03-9) untuk tiga bagian pertama sebagai seleksi ketat yang lebih rendah.Kemudian gunakan 20 g/ml sebagai rejimen yang lebih ketat untuk tiga bagian berikutnya.
Sel diunggulkan dalam ruang 12-sumur (Ibidi, #81201) dengan kepadatan sekitar 20.000 sel per sumur.Untuk meningkatkan adesi sel HEK293T, tambahkan 50 g/ml fibronektin (Corning, #356008) yang diencerkan dalam saline buffer fosfat (PBS, Sangon, #B640435) pada 37°C.Kamar-kamar tersebut diberi perlakuan awal selama 1 jam dan kemudian dihilangkan dengan PBS.Setelah 24 jam, sel dicuci sekali dengan PBS, diinkubasi dengan 1 mM probe 3 dalam larutan garam seimbang Hanks segar (HBSS, Gibco, #14025092) selama 1 jam pada suhu 37°C, dan kemudian diinkubasi dengan LED biru (460 nm ).) diiradiasi selama 10 menit pada suhu kamar.Setelah itu, sel dicuci dua kali dengan PBS dan difiksasi dengan formaldehid 4% dalam PBS (Sangon, #E672002) selama 15 menit pada suhu kamar.Kelebihan formaldehida dihilangkan dari sel tetap dengan mencuci tiga kali dengan PBS.Sel kemudian ditembus dengan 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) dalam PBS dan dicuci 3 kali dengan PBS.Kemudian keluarkan chamber dan tambahkan ke setiap sampel 25 l campuran reaksi klik yang mengandung 50 M Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) dan 0,5 mg/ml natrium askorbat (Aladdin, no. S105024) dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.Setelah reaksi sekejap, sel dicuci enam kali dengan PBS yang mengandung 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) dan kemudian diblokir dengan 5% BSA (Abcone, #B24726) dalam PBST selama 30 menit pada suhu kamar.
Untuk colocalization immunostaining, sel diinkubasi dengan antibodi primer sesuai dengan kondisi yang ditunjukkan: tikus anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kelinci anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), antibodi anti-calnexin poliklonal kelinci (1:500, Abcam, #ab22595) atau antibodi monoklonal A/C kelinci anti-lamin (1:500; CST, #2032) pada suhu 4 °C semalaman.Setelah dicuci 3 kali dengan PBST, sel diinkubasi dengan antibodi sekunder: kambing anti-kelinci Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diencerkan 1:1000, kambing anti-tikus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diencerkan 1:1000.pengenceran Encerkan pada suhu kamar selama 30 menit.Sel kemudian dicuci 3 kali dengan PBST dan diwarnai dengan DAPI (Thermo, #D1306) dalam PBS selama 10 menit pada suhu kamar.Setelah 3 kali pencucian dengan PBS, sel disegel dalam 50% gliserol (Sangon, #A600232) dalam PBS untuk pencitraan.Gambar imunofluoresen diperoleh menggunakan mikroskop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 dan perangkat lunak ZNE 3.5.
Untuk pencitraan fluoresen oksigen singlet, sel dicuci dua kali dengan buffer HEPES Hanks sebelum menambahkan 100 nM Si-DMA dalam buffer HEPES Hanks (DOJINDO, #MT05).Setelah terpapar cahaya, sel diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37°C selama 45 menit.Sel kemudian dicuci dua kali dengan buffer HEPES Hanks dan diwarnai dengan Hoechst dalam buffer HEPES Hanks selama 10 menit pada suhu kamar dan divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal ZEISS LSM 900., #M36008) dalam buffer HBSS yang mengandung kalsium dan magnesium.Setelah terpapar cahaya atau doksorubisin (MCE, #HY-15142A), sel diinkubasi dalam inkubator CO2 pada 37°C selama 10 menit, dicuci dua kali dengan buffer HBSS, dan diinkubasi dengan Hoechst dalam buffer HBSS pada suhu kamar.menit.Doxorubicin digunakan sebagai kontrol probe positif di mana sel diperlakukan dengan 20 M doxorubicin dalam HBSS yang mengandung 1% BSA selama 30 menit.Gambar imunofluoresen diperoleh dengan menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 900.
Sel HEK293T yang mengekspresikan mito-miniSOG secara stabil diunggulkan dengan kepadatan sekitar 30% dalam cawan 15 cm.Setelah 48 jam, ketika ~ 80% pertemuan tercapai, sel dicuci sekali dengan PBS, diinkubasi dengan 1 mM Probe 3 dalam buffer HBSS segar selama 1 jam pada 37 ° C dan kemudian diterangi dengan LED biru selama 10 menit di kamar suhu..Setelah itu, sel-sel dicuci dua kali dengan PBS, dikikis dan disuspensikan kembali dalam buffer PBS dingin yang mengandung inhibitor protease bebas EDTA (MCE, #HY-K0011).Sel dilisiskan dengan sonikasi ujungnya selama 1 menit (1 detik aktif dan 1 detik mati pada amplitudo 35%).Campuran yang dihasilkan disentrifugasi pada 15.871 xg selama 10 menit pada suhu 4°C untuk menghilangkan debris, dan konsentrasi supernatan diatur menjadi 4 mg/mL menggunakan alat uji protein BCA (Beyotime, #P0009).Campurkan 1 ml lisat di atas dengan 0,1 mM biotin azida fotodegradable (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), ligan 0,1 mM TBTA (Aladdin, #T162437), dan 1 mM inkubator CuSO4 dengan alas Rotasi selama 1 jam pada suhu kamar.Setelah reaksi cepat, tambahkan campuran ke dalam larutan yang telah dicampur sebelumnya (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) dalam botol kaca 10 ml.Sampel dicampur dan disentrifugasi pada 4500 g selama 10 menit pada suhu kamar.Larutan bagian bawah dan atas dibuang, endapan dicuci dua kali dengan 1 ml metanol dan disentrifugasi pada 15871xg selama 5 menit pada suhu 4°C.Tambahkan 1 ml 8 M urea (Aladdin, no. U111902) dalam 25 mM amonium bikarbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) untuk melarutkan endapan.Sampel dilarutkan dengan 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 dalam 25 mM ABC) selama 40 menit pada 55°C diikuti dengan penambahan 15 mM iodoacetamide segar (Sangon, #A600539) pada suhu kamar dalam gelap.Alkilasi dalam waktu 30 menit..Tambahan 5 mM dithiothreitol ditambahkan untuk menghentikan reaksi.Siapkan kira-kira 100 l NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) untuk setiap sampel dengan mencuci 3 kali dengan 1 ml PBS.Larutan proteom di atas diencerkan dengan 5 ml PBS dan diinkubasi dengan manik-manik agarosa NeutrAvidin yang telah dicuci selama 4 jam pada suhu kamar.Manik-manik kemudian dicuci 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandung 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandung urea 1M, dan 3 kali dengan 5 ml ddH2O.Manik-manik kemudian dipanen dengan sentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam 200 l 25 mM ABC yang mengandung 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) dan 20 ng/μl tripsin (Promega, #V5280).Tripsinisasi semalaman pada suhu 37°C dengan rotasi.Reaksi dihentikan dengan menambahkan asam format (Thermo, #A117-50) hingga pH mencapai 2-3.Manik-manik dicuci 3 kali dengan 1 ml PBS yang mengandung 0,2% SDS, 3 kali dengan 1 ml PBS yang mengandung 1 M urea, dan kemudian 3 kali dengan 1 ml air suling.Peptida yang dimodifikasi dilepaskan dengan lisis ringan (365 nm) selama 90 menit menggunakan 200 l 70% MeOH.Setelah sentrifugasi, supernatan dikumpulkan.Manik-manik kemudian dicuci sekali dengan 100 l 70% MeOH dan supernatan dikumpulkan.Sampel dikeringkan dalam konsentrator vakum Speedvac dan disimpan pada suhu -20°C hingga analisis.
Untuk mengidentifikasi dan mengukur peptida termodifikasi oksigen singlet, sampel dilarutkan kembali dalam asam format 0,1% dan 1 g peptida dianalisis menggunakan spektrometer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid yang dilengkapi dengan sumber nano ESI dari Tune dan Xcalibur dari perangkat lunak vendor 4.3.Sampel dipisahkan pada kolom kapiler internal berukuran 75 m × 15 cm dengan bahan C18 3 m (ReproSil-pur, #r13.b9.) dan dihubungkan ke sistem EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptida dipisahkan dengan kromatografi gradien linier 95 menit dari pelarut B 8% menjadi pelarut B 50% (A = 0,1% asam format dalam air, B = 0,1% asam format dalam 80% asetonitril), kemudian meningkat secara linier menjadi 98% B menit dalam 6 menit pada laju aliran 300 nl/menit.Orbitrap Fusion Lumos mengumpulkan data secara bergantian antara pemindaian MS penuh dan pemindaian MS2 tergantung pada datanya.Tegangan sputtering diatur ke 2,1 kV dan suhu kapiler transpor ion adalah 320 °C.Spektrum MS (350-2000 m/z) dikumpulkan dengan resolusi 120.000, AGC 4 × 105, dan waktu input maksimum 150 ms.10 prekursor bermuatan ganda yang paling umum di setiap pemindaian penuh difragmentasi menggunakan HCD dengan energi tumbukan yang dinormalisasi 30%, jendela isolasi quadrupole 1,6 m/z, dan pengaturan resolusi 30.000.Target AGC untuk spektrometri massa tandem menggunakan 5×104 dan waktu input maksimum 150 ms.Pengecualian dinamis diatur ke 30 detik. Ion yang tidak ditetapkan atau yang bermuatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS. Ion yang tidak ditetapkan atau yang bermuatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS. еназначенные оны оны арядом 1+ >7+ отклонены /МС. Ion yang tidak ditetapkan atau ion dengan muatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS.1+ >7+ MS/MS。1+ >7+ MS/MS。 еуказанные оны оны арядами 1+ >7+ отклонены /МС. Ion yang tidak ditentukan atau ion dengan muatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS.
Data mentah diproses menggunakan platform komputasi FragPipe berbasis MSFragger.Bias massa dan asam amino yang sesuai ditentukan menggunakan algoritma pencarian terbuka dengan toleransi massa prekursor -150 hingga 500 Da.Peptida yang dimodifikasi kemudian diidentifikasi menggunakan modifikasi histidin dengan perolehan massa +229.0964 dan +247.1069 Da dalam PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Sel yang mengekspresikan gen miniSOG yang menyatu secara stabil dilapisi dalam piringan 6 cm.Setelah mencapai ~ 80% pertemuan, sel dicuci sekali dengan HBSS (Gibco, #14025092), kemudian diinkubasi dengan probe kimia dalam HBSS selama 1 jam pada suhu 37 ° C dan diterangi dengan cahaya biru.10W LED selama 20 menit pada suhu kamar.Untuk menentukan jenis spesies oksigen reaktif yang terlibat dalam PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 M H2O2, 10 mM NaN3 ditambahkan ke dalam sel sebagai suplemen.Setelah dicuci dengan PBS dingin, sel dikerok, dikumpulkan dalam tabung sentrifus 1,5 ml, dan disonikasi dengan ujung selama 1 menit dalam 200 l PBS dengan 1x protease inhibitor tanpa EDTA (1 detik dan 1 detik tanpa, amplitudo 35%).Campuran yang dihasilkan disentrifugasi pada 15.871 × g selama 10 menit pada suhu 4 °C dan konsentrasi supernatan diatur menjadi 1 mg/mL menggunakan alat uji protein BCA.Sekitar 50 l lisat di atas diinkubasi dengan 0,1 mM rhodamin azida (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligan, dan 1 mM CuSO4 selama 1 jam pada suhu kamar dengan rotasi dari bawah ke atas.Setelah reaksi klik, pengendapan dengan aseton dilakukan dengan menambahkan 250 l aseton pra-dingin ke sampel, inkubasi pada -20 ° C selama 20 menit dan sentrifugasi pada 6010 × g selama 10 menit pada 4 ° C.Kumpulkan pelet dan didihkan dalam 50 l 1x buffer Laemmli selama 10 menit pada suhu 95 °C.Sampel kemudian dianalisis pada gel panjang SDS-PAGE dan divisualisasikan menggunakan sistem pencitraan Bio-rad ChemiDoc MP Touch dengan perangkat lunak Image Lab Touch.
Ekspresi dan pemurnian protein miniSOG-6xHis rekombinan dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya.Secara singkat, sel E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ditransformasikan dengan pET21a-miniSOG-6xHis dan ekspresi protein diinduksi dengan 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Setelah lisis sel, protein dimurnikan menggunakan manik-manik agarosa Ni-NTA (MCE, no. 70666), didialisis terhadap PBS, dan disimpan pada -80 °C.
Untuk uji kedekatan label in vitro berbasis antibodi, campurkan 100 M miniSOG murni, 1 mM probe 3, dan 1 g antibodi monoklonal tikus anti-label (TransGen, #HT501-01) dalam PBS hingga volume reaksi total 50 l..Campuran reaksi disinari dengan lampu LED biru selama 0, 2, 5, 10, dan 20 menit pada suhu kamar.Campuran diinkubasi dengan 0,1 mM biotin-PEG3-azida (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligan TBTA, dan 1 mM CuSO4 selama 1 jam pada suhu kamar di atas pengocok gerak.Setelah reaksi cepat, tambahkan 4x buffer Laemmli langsung ke dalam campuran dan didihkan pada suhu 95°C selama 10 menit.Sampel dianalisis pada gel SDS-PAGE dan dianalisis dengan western blotting dengan streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Peptida sintetik yang mengandung histidin dengan amidasi terminal-C (LHDALDAK-CONH2) digunakan untuk menganalisis pelabelan in vitro berbasis peptida terdekat.Dalam pengujian ini, 100 M miniSOG murni, 10 mM probe 3 dan 2 g/ml peptida sintetis dicampur dalam PBS dalam volume reaksi total 50 l.Campuran reaksi disinari dengan lampu LED biru selama 1 jam pada suhu kamar.Satu mikroliter sampel dianalisis menggunakan sistem LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spektrometer massa dengan perangkat lunak analisis spektrum MassLynx).
Sel HEK293T yang mengekspresikan gen fusi miniSOG secara stabil diunggulkan dalam cawan 10 cm untuk garis dengan lokalisasi organel yang berbeda (Mito, ER, Nucleus) dan cawan 15 cm untuk garis Parkin-miniSOG dan BRD4-miniSOG.Setelah mencapai ~ 90% pertemuan, sel-sel dicuci sekali dengan HBSS, kemudian diinkubasi dengan probe 3 dalam HBSS selama 1 jam pada 37 ° C dan diterangi dengan LED biru 10 W pada suhu kamar.Untuk pelabelan non-kontak Parkin, 10 M pembawa proton karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) dengan probe 3 dalam HBSS ditambahkan selama 1 jam pada 37°C.Langkah-langkah lisis sel, kimia klik, reduksi dan alkilasi sama seperti yang dijelaskan di atas, kecuali bahwa 2 mg lisat ditambahkan dan biotin PEG3 azida digunakan dalam reaksi klik sebagai ganti biotin azida yang dapat difotodegradasi.Setelah pengayaan, manik-manik dicuci 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandung 0,2% SDS, 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandung 1 M urea, dan 3 kali dengan 5 ml PBS.Setelah itu, 2 g tripsin ditambahkan ke 300 l 25 mM ABC yang mengandung 1 M urea untuk membelah protein semalaman pada suhu 37°C.Reaksi dihentikan dengan menambahkan asam format hingga tercapai pH 2-3.Setelah tripsinisasi pada manik-manik, larutan peptida dihilangkan garamnya menggunakan kolom SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) dan dikeringkan dalam konsentrator vakum Speedvac.Peptida dilarutkan kembali dalam asam format 0,1% dan 500 ng peptida dianalisis menggunakan spektrometer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid yang dilengkapi dengan sumber nano-ESI yang dijelaskan di atas.Peptida dipisahkan pada kolom RP-HPLC komersial (75 m x 2 cm) (Thermo, no. 164946) dan kolom RP-HPLC analitis (75 m x 25 cm) (Thermo, no. 164941), keduanya diisi dengan 2 m.gradien dari 8% menjadi 35% ACN dalam 60 menit, kemudian meningkat secara linier menjadi 98% B dalam 6 menit pada laju aliran 300 Nl/menit.Spektrum MS (350-1500 m/z) dikumpulkan dengan resolusi 60.000, AGC 4 × 105, dan waktu input maksimum 50 ms.Ion yang dipilih secara berurutan difragmentasi oleh HCD dalam siklus 3 detik dengan energi tumbukan yang dinormalisasi 30%, jendela isolasi kuadrupole 1,6 m/z, dan resolusi 15000. Target AGC spektrometer massa tandem 5 × 104 dan waktu injeksi maksimum dari 22 ms digunakan.Pengecualian dinamis diatur ke 45 detik. Ion yang tidak ditetapkan atau yang bermuatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS. Ion yang tidak ditetapkan atau yang bermuatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS. еназначенные оны оны арядом 1+ >7+ отклонены /МС. Ion yang tidak ditetapkan atau ion dengan muatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS.1+ >7+ MS/MS。1+ >7+ MS/MS。 еуказанные оны оны арядами 1+ >7+ отклонены /МС. Ion yang tidak ditentukan atau ion dengan muatan 1+ dan >7+ ditolak untuk MS/MS.
Langkah-langkah persiapan sampel hingga pengayaan manik-manik NeutrAvidin sama seperti dalam analisis LC-MS/MS yang dijelaskan di atas.Sekitar 50 g lisat digunakan sebagai input untuk kontrol pemuatan dan 2 mg lisat digunakan untuk reaksi klik.Setelah pengayaan dan pencucian dengan neutravidin, protein terikat dielusi dengan menambahkan 50 l buffer Laemmli ke butiran resin agarosa dan dididihkan pada 95°C selama 5 menit.Input beban kontrol dan sampel yang diperkaya manik dianalisis dengan SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) dengan metode Western blot standar.Membran diblokir dengan susu skim 5% (Sangon, #A600669) dalam TBS yang mengandung 0,1% tween-20 (TBST) dan diinkubasi secara berurutan dengan antibodi primer dan sekunder.Antibodi primer diencerkan 1:1000 dalam susu skim 5% dalam TBST dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C.Antibodi sekunder digunakan dengan perbandingan 1:5000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.Membran divisualisasikan dengan chemiluminescence menggunakan sistem pencitraan Chemidoc MP.Semua pemindaian noda dan gel yang belum dipotong pada gambar disajikan sebagai data mentah.
Antibodi primer yang digunakan dalam penelitian ini meliputi antibodi monoklonal anti-SFPQ kelinci (CST, no. 71992), antibodi monoklonal anti-FUS kelinci (CST, no. 67840), antibodi poliklonal anti-NSUN2 kelinci (Proteintech, no. 20854-1- AP), antibodi poliklonal anti-mSin3A kelinci (Abcam, #ab3479), antibodi monoklonal anti-tag tikus (TransGen, #HT201-02), antibodi monoklonal anti-β-aktin tikus (TransGen, #HC201-01), anti kelinci - antibodi monoklonal CDK2 (ABclonal, #A0094), antibodi monoklonal kelinci terhadap CTBP1 (ABclonal, #A11600), antibodi poliklonal kelinci terhadap DUT (ABclonal, #A2901), antibodi poliklonal kelinci terhadap PSMC4 (ABclonal, #A2505), anti- Antibodi poliklonal DNAJB1 (ABklonal, # A5504).Antibodi ini digunakan pada pengenceran 1:1000 dalam susu skim 5% di TBST.Antibodi sekunder yang digunakan dalam penelitian ini termasuk IgG anti-kelinci (TransGen, #HS101-01), IgG anti-tikus (TransGen, #HS201-01) pada pengenceran 1:5000.
Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah BRD4 berinteraksi dengan SFPQ, sel HEK293T dan BRD4-miniSOG yang stabil yang mengekspresikan HEK293T secara berlebihan dilapisi dalam piringan 10 cm.Sel dicuci dengan PBS dingin dan dilisiskan dalam 1 ml buffer lisis Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) dengan protease inhibitor bebas EDTA selama 30 menit pada suhu 4°C.Setelah itu, lisat dikumpulkan dalam tabung sentrifus 1,5 ml dan disentrifugasi pada 15.871 xg selama 10 menit pada suhu 4°C.Supernatan dipanen dan diinkubasi dengan 5 g antibodi monoklonal tikus berlabel anti-V5 (CST, #80076) semalaman pada suhu 4°C.Cuci sekitar 50 l manik-manik magnetik protein A/G (MCE, #HY-K0202) dua kali dengan PBS yang mengandung 0,5% Tween-20.Kemudian sel lisat diinkubasi dengan magnetic beads selama 4 jam pada suhu 4°C dengan rotasi dari bawah ke atas.Kemudian manik-manik dicuci empat kali dengan 1 ml buffer PBST dan direbus pada 95 ° C selama 5 menit.Sampel dianalisis pada gel SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF menggunakan metode Western blot standar.Membran diblokir dalam susu skim 5% di TBST dan diinkubasi secara berurutan dengan antibodi primer dan sekunder.Antibodi Primer Antibodi anti-SFPQ Antibodi monoklonal kelinci (CST, #71992) digunakan dengan perbandingan 1:1000 dalam susu skim 5% dalam TBST dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C.IgG anti-kelinci digunakan dengan perbandingan 1:5000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.Membran divisualisasikan dengan chemiluminescence menggunakan sistem pencitraan Chemidoc MP.
Semua struktur yang digunakan untuk analisis Solvent Accessible Surface Area (SASA) diperoleh dari Protein Data Bank (PDB)52 atau Basis Data Struktur Protein AlphaFold53.SASA absolut dihitung untuk setiap residu menggunakan program FreeSASA.Hanya data SASA yang lengkap dan tidak ambigu untuk histidin berlabel dan tetangganya yang digunakan untuk mendapatkan rata-rata SASA untuk setiap struktur.Aksesibilitas pelarut relatif (RSA) untuk setiap histidin dihitung dengan membagi nilai SASA absolut dengan luas permukaan residu maksimum empiris yang mungkin tersedia untuk pelarut.Semua histidin kemudian diklasifikasikan sebagai tersembunyi jika RSA rata-rata di bawah 20%, jika tidak terpapar56.
File mentah yang diperoleh dalam mode DDA dicari menggunakan Proteome Discoverer (v2.5) atau MSfragger (Fragpipe v15.0) dalam database protein terverifikasi SwissProt yang sesuai yang mengandung kontaminan umum.Peptida membutuhkan tripsin lengkap dengan dua situs pembelahan yang hilang, metilasi karbamoil sebagai modifikasi tetap dan oksidasi metionin sebagai modifikasi dinamis.Toleransi berat prekursor dan fragmen ditetapkan masing-masing ke 10 ppm dan 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Hit kontaminan telah dihapus, dan protein disaring untuk mendapatkan tingkat penemuan palsu <1%. Hit kontaminan telah dihapus, dan protein disaring untuk mendapatkan tingkat penemuan palsu <1%. опадания агрязняющих еществ алены, а елки отфильтрованы, обы олучить оэффициент ожного обнаружения <1%. Hit kontaminan telah dihapus dan protein disaring untuk memberikan tingkat deteksi palsu <1%.<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 опадания агрязняющих еществ алены, а елки отфильтрованы остижения овня ожных обнаружений <1%. Hit kontaminan telah dihapus dan protein disaring untuk mencapai tingkat positif palsu <1%.Untuk analisis kuantitatif tanpa menggunakan label, kandungan protein yang dinormalisasi dari tiga pengulangan biologis digunakan.Analisis lokalisasi subselular protein dilakukan dengan menggunakan analisis Gene Ontology (GO) dari DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 dan database yang dikompilasi dan diterbitkan oleh grup Alice Ting.Peta gunung berapi diperoleh dari Perseus (v1.6.15.0). Perubahan lipatan kelimpahan protein diuji untuk signifikansi statistik menggunakan uji-t dua sisi, dan hit protein diidentifikasi dengan perubahan kelimpahan >2 (kecuali dinyatakan lain) dan nilai p <0,05. Perubahan lipatan kelimpahan protein diuji untuk signifikansi statistik menggunakan uji-t dua sisi, dan hit protein diidentifikasi dengan perubahan kelimpahan >2 (kecuali dinyatakan lain) dan nilai p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Perubahan lipatan konten protein diuji untuk signifikansi statistik menggunakan uji-t dua sisi, dan kecocokan protein diidentifikasi dengan perubahan konten >2 (kecuali dinyatakan lain) dan nilai p <0,05.t > 2（除非另有说明）和p <0,05。t 检验 蛋白质 统计 确定 蛋白质 中 的 > 2 （另 p <0,05。 аескую ачимость атных енений одержания елка оверяли ользованием ороннего t-критерия, а овпадения елков опресе t-критерия, а овпадения елков опреоизме Signifikansi statistik dari perubahan lipatan dalam kandungan protein diuji menggunakan uji-t dua sisi, dan kecocokan protein ditentukan untuk perubahan kandungan >2 (kecuali dinyatakan lain) dan nilai-p <0,05.Analisis interaksi protein dilakukan menggunakan analisis GO bersama dengan database String.
Tiga ulangan biologis dilakukan dengan hasil yang serupa.Analisis statistik dilakukan dengan GraphPad Prism (perangkat lunak GraphPad) dan plot gunung berapi dibuat dengan Perseus (v1.6.15.0).Untuk membandingkan kedua kelompok, nilai p ditentukan menggunakan uji-t Student dua sisi.Hanya protein tunggal yang diidentifikasi setidaknya dua kali dalam kelompok eksperimen yang dimasukkan dalam plot gunung berapi, dan nilai-nilai yang hilang yang sesuai dalam kelompok kontrol diganti dengan Perseus dari distribusi normal sehingga nilai-p dapat dihitung.Bilah kesalahan mewakili mean ± standar deviasi.Dalam analisis proteomik untuk analisis statistik, kelimpahan protein yang muncul di setidaknya dua ulangan biologis dipertahankan.Metode statistik tidak digunakan untuk menentukan ukuran sampel sebelumnya.Eksperimennya tidak acak.Para peneliti tidak buta terhadap tugas selama percobaan dan evaluasi hasil.
Untuk informasi lebih lanjut tentang desain studi, lihat abstrak Laporan Penelitian Alam yang ditautkan ke artikel ini.
Data spektrometri massa yang diperoleh dalam penelitian ini dikirimkan ke ProteomeXchange Consortium melalui repositori mitra iProX57 di bawah dataset ID PXD034811 (dataset PDPL-MS).Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.Artikel ini menyediakan data asli.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Mengenal lingkungan: menggunakan biotinilasi yang bergantung pada kedekatan untuk mengkarakterisasi kompleks protein dan memetakan organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Mengenal lingkungan: menggunakan biotinilasi yang bergantung pada kedekatan untuk mengkarakterisasi kompleks protein dan memetakan organel.Gingras, AS, Abe, KT dan Raut, B. Keakraban dengan lingkungan: menggunakan biotinilasi yang bergantung pada kedekatan untuk mengkarakterisasi kompleks protein dan memetakan organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pengertian lingkungan: memanfaatkan ketergantungan lingkungan pada kehidupan biologis.Gingras, AS, Abe, KT dan Raut, B. Memahami kedekatan: karakterisasi kompleks protein dan pemetaan organel menggunakan biotinilasi yang bergantung pada kedekatan.Saat ini.Pendapat saya.Bahan kimia.biologi 48, 44–54 (2019).
Geri, JB dkk.Memetakan lingkungan mikro dengan mentransfer energi Dexter ke sel imun.Sains 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL dkk.Jaringan skala dua-proteom mendeteksi remodeling spesifik sel dari interaksi manusia.Sel 184, 3022–3040.e3028 (2021).