Berita

Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Sel kanker telah mengembangkan berbagai mekanisme untuk mengatasi stres seluler dan terus berkembang.Protein kinase R (PKR) dan aktivator proteinnya (PACT) adalah penanggap awal yang memantau berbagai sinyal stres yang mengarah pada penghambatan proliferasi sel dan apoptosis.Namun, regulasi jalur PACT-PKR dalam sel kanker sebagian besar masih belum diketahui.Di sini, kami menemukan bahwa long non-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) terlibat langsung dalam penghambatan jalur PACT-PKR dan mendorong proliferasi sel kanker.Menggunakan skrining fungsional skala besar dari lncRNA terkait kanker CRISPRi 971, kami menemukan bahwa DARS-AS1 dikaitkan dengan peningkatan proliferasi sel kanker secara signifikan.Oleh karena itu, knockout DARS-AS1 menghambat proliferasi sel dan mendorong apoptosis sel kanker di berbagai lini sel kanker in vitro dan secara signifikan mengurangi pertumbuhan tumor in vivo.Secara mekanis, DARS-AS1 mengikat langsung ke domain aktivasi PACT dan mencegah interaksi PACT-PKR, sehingga mengurangi aktivasi PKR, fosforilasi eIF2α, dan menghambat kematian sel apoptosis.Secara klinis, DARS-AS1 diekspresikan secara luas pada beberapa kanker, dan ekspresi berlebih dari lncRNA ini menunjukkan prognosis yang buruk.Studi ini menjelaskan regulasi spesifik kanker dari jalur PACT-PKR oleh DARS-AS1 lncRNA dan memberikan target lain untuk prognosis dan pengobatan kanker.
Kemampuan untuk beradaptasi dengan stres merupakan karakteristik penting dari kelangsungan hidup dan proliferasi sel kanker.Proliferasi yang cepat dan ciri-ciri metabolisme puncak kanker di lingkungan mikro yang keras—kekurangan nutrisi, hipoksia, dan pH rendah—yang dapat memicu jalur pensinyalan kematian sel.Disregulasi gen sensitif stres seperti p535, protein kejutan panas 6, 7, KRAS8, 9, dan HIF-110, 11, 12, 13 sering diamati pada kanker, sehingga menghalangi apoptosis dan meningkatkan kelangsungan hidup.
Protein kinase R (PKR) adalah sensor stres penting dan subunit kinase dari faktor inisiasi eukariotik 2α (eIF2α), regulator translasi yang menghubungkan stres seluler dengan kematian sel.PKR awalnya diidentifikasi sebagai protein antivirus dengan mendeteksi RNA untai ganda asing (dsRNA).Setelah aktivasi, PKR memfosforilasi eIF2α untuk menghambat sintesis protein virus dan seluler14,15,16.PACT (protein aktivator PKR) telah diidentifikasi sebagai protein aktivator PKR pertama tanpa adanya dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Melalui interaksi langsung dengan PKR, PACT mentransduksi berbagai tekanan (kelaparan serum, perawatan peroksida atau arsenit) ke PKR dan jalur pensinyalan hilir.Selain fosforilasi eIF2α, aktivasi PKR yang dimediasi PACT memicu berbagai peristiwa yang terkait dengan respons stres, termasuk perubahan status redoks melalui jalur PI3K/Akt24, peningkatan pemeriksaan kerusakan DNA melalui p5325,26 dan NF-κB27,28 Mengatur transkripsi, 29. Mengingat peran penting mereka dalam respons stres, proliferasi, apoptosis, dan proses seluler utama lainnya, PKR dan PACT menjanjikan target terapi untuk banyak penyakit, terutama kanker30,31,32,33.Namun, terlepas dari signifikansi fungsional dan biologis pleiotropik ini, regulasi aktivitas PACT/PKR dalam sel kanker tetap sulit dipahami.
lncRNA adalah transkrip yang lebih besar dari 200 nukleotida tanpa potensi penyandi protein.Sejak proyek pengurutan seluruh genom mutakhir telah mengidentifikasi ribuan lncRNA, 35,36 banyak upaya telah dilakukan untuk menjelaskan fungsi biologisnya.Semakin banyak penelitian menunjukkan bahwa lncRNA terlibat dalam banyak proses biologis37 termasuk regulasi inaktivasi kromosom X38,39, pencetakan40, transkripsi41,42, translasi43 dan bahkan pertumbuhan kanker44,45,46,47.Studi-studi ini melaporkan bahwa banyak lncRNA terlibat dalam jalur PACT/PKR.Satu studi tersebut menunjukkan bahwa lncRNA ASPACT menghambat transkripsi PACT dan meningkatkan retensi nuklir mRNA PACT.Penelitian lain menunjukkan bahwa lncRNA nc886 mengikat PKR dan menghambat fosforilasinya49,50.Sejauh ini, lncRNA yang mengatur aktivasi PKR yang dimediasi PACT belum dilaporkan.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) telah diidentifikasi sebagai lncRNA51,52,53,54 onkogenik.Melalui regulasi miP-194-5p53, miP-12952 dan miP-532-3p51, DARS-AS1 masing-masing telah terbukti mendorong pertumbuhan karsinoma sel ginjal sel jernih, karsinoma tiroid, dan karsinoma paru-paru non-sel kecil.Tong dan rekannya juga menemukan bahwa DARS-AS1 mendorong perkembangan myeloma dengan menjaga stabilitas motif pengikatan RNA protein 39 (RBM39).Namun, tidak ada penelitian yang dilakukan tentang apakah lncRNA ini terlibat dalam regulasi aktivasi PACT-PKR dan respons stres sel kanker.
Di sini, kami melakukan layar hilangnya fungsi skala besar menggunakan sistem CRISPRi dan menentukan bahwa DARS-AS1 lncRNA mempromosikan proliferasi beberapa jenis sel kanker.Selain itu, kami telah mengidentifikasi mekanisme utama: DARS-AS1 mengikat langsung ke PACT, menghambat pengikatan PACT dan PKR, mencegah fosforilasi eIF2α, substrat PKR yang lebih rendah, dan pada akhirnya menghambat kematian sel apoptosis.Sebagai kesimpulan, pekerjaan kami mengungkapkan DARS-AS1 lncRNA sebagai pengatur jalur PACT-PKR dan target potensial untuk pengobatan dan prognosis kanker.
Studi profil genomik ekstensif telah mengidentifikasi ratusan lncRNA yang terkait dengan kanker.Namun, fungsinya sebagian besar masih belum diketahui56.Untuk mengidentifikasi kandidat lncRNA yang menjanjikan yang terlibat dalam perkembangan kanker, kami melakukan layar hilangnya fungsi untuk mengurangi proliferasi dalam garis sel kanker kolorektal SW620 menggunakan sistem CRISPRi (Gbr. 1a).Fitur unik dari garis sel kanker usus besar SW480 dan SW620 adalah bahwa mereka berasal dari tumor primer dan sekunder pada satu pasien.Ini memberikan perbandingan yang berharga untuk mempelajari perubahan genetik dalam perkembangan kanker usus besar lanjut.Oleh karena itu, kami menganalisis transkriptom garis sel kanker kolorektal (SW480 dan SW620) menggunakan pengurutan RNA dan mengumpulkan beberapa lncRNA fungsional potensial dari literatur yang diterbitkan.Berdasarkan hasil ini, kami merancang pustaka sgRNA gabungan yang berisi 7355 oligo sgRNA yang menargetkan 971 lncRNA terkait kanker dan 500 oligo sgRNA yang tidak ditargetkan untuk kontrol negatif (Data Tambahan 1).
Representasi skematis penyaringan menggunakan sistem CRISPRi.pengayaan b sgRNA setelah penyaringan.Garis putus-putus horizontal mewakili log2 (perubahan lipatan) = ±0,58.Garis putus-putus vertikal menunjukkan nilai p = 0,05.Titik hitam mewakili sgRNA non-target (ditunjuk sebagai NC).Titik merah adalah sgRNA yang menargetkan DARS-AS1.Titik biru adalah sgRNA yang menargetkan LINC00205, lncRNA onkogenik yang dijelaskan sebelumnya.fold change = (pembacaan yang dinormalisasi, hari ke-17)/(pembacaan yang dinormalisasi, hari ke-0).c knockdown DARS-AS1 sgRNA menghambat pertumbuhan sel.Bilah kesalahan mewakili ± standar deviasi dari tiga percobaan.* p 0,05, ** p 0,01 uji-t Student dua sisi.d Ekspresi DARS-AS1 pada tumor (set data TCGA).em Ekspresi DARS-AS1 dalam sampel normal dan tumor berpasangan dari pasien dengan BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, dan COAD, masing-masing (set data TCGA).nilai p diperoleh dengan menggunakan uji-t Student dua sisi berpasangan.
Setelah membangun plasmid dan mengemas lentivirus, kami mentransduksi garis sel kanker kolorektal dCas9-SW620 dengan pustaka di atas dalam empat percobaan infeksi independen.Multiplisitas infeksi (MOI) untuk infeksi ini adalah 0,1-0,3, menunjukkan bahwa setiap sel hanya dapat ditransfeksi dengan satu sgRNA.Setelah 18 hari kultur in vitro, profil pengayaan sgRNA target menurun atau meningkat setelah penyaringan, sementara jumlah oligonukleotida kontrol yang tidak ditargetkan tetap relatif tidak berubah dibandingkan dengan profil pra-penyaringan, menunjukkan bahwa target kami memiliki spesifik layar yang sangat tinggi. Perpustakaan.Beras.1b dan tabel tambahan 1). LINC00205, yang sebelumnya dilaporkan mempromosikan kanker paru-paru dan perkembangan kanker hati58,59,60, disaring (log2 (foldchange) < -0,58, nilai p <0,05), mengkonfirmasikan keandalan skrining ini (Gbr. 1b). LINC00205, yang sebelumnya dilaporkan mempromosikan kanker paru-paru dan perkembangan kanker hati58,59,60, disaring (log2 (foldchange) < -0,58, nilai p <0,05), mengkonfirmasikan keandalan skrining ini (Gbr. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, yang sebelumnya dilaporkan mempromosikan perkembangan kanker paru-paru dan kanker hati58,59,60, dikeluarkan (log2 (perubahan lipat) <-0,58, nilai-p <0,05), mengkonfirmasikan kekokohan skrining ini (Gbr. .1b) . LINC00205 58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0,58，p < 0,05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0,58，p < 0,05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, yang sebelumnya dilaporkan untuk mempromosikan perkembangan kanker paru-paru dan hati58,59,60, dikeluarkan (log2 (perubahan lipat) <-0,58, nilai-p <0,05), mengkonfirmasikan kekokohan skrining ini (Gbr. .1b).
Di antara semua lncRNA yang diuji, DARS-AS1 juga disaring, dengan tiga oligonukleotida sgRNA serumpun berkurang secara signifikan setelah 18 hari kultur, menunjukkan bahwa knockdown lncRNA ini menghasilkan pengurangan proliferasi kanker (Gbr. 1b).Hasil ini lebih lanjut didukung oleh analisis MTS dalam sel kanker kolorektal yang menunjukkan bahwa tingkat pertumbuhan sel knockdown DARS-AS1 hanya berkurang setengahnya dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar 1c) dan konsisten dengan laporan sebelumnya dari beberapa jenis kanker lainnya.: kanker ginjal sel jernih, kanker tiroid dan kanker paru non-sel kecil51,52,53,55.Namun, fungsi dan mekanisme molekulernya pada kanker kolorektal masih belum diselidiki.Oleh karena itu, kami memilih lncRNA ini untuk studi lebih lanjut.
Untuk mempelajari ekspresi DARS-AS1 pada pasien, kami menganalisis 10.327 sampel tumor secara komprehensif dari proyek Cancer Genome Atlas (TCGA).Hasil kami menunjukkan bahwa DARS-AS1 diekspresikan secara luas dan diregulasi secara signifikan dalam sel sehat dalam berbagai tumor, termasuk adenokarsinoma usus besar (COAD), karsinoma sel jernih ginjal (KIRC), dan karsinoma sel papiler ginjal (KIRP)..Sangat sedikit (Gbr. 1d dan Gambar Tambahan 1a, b). Analisis sampel sehat / tumor berpasangan lebih lanjut mengkonfirmasi ekspresi DARS-AS1 yang secara signifikan lebih tinggi pada tumor karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel jernih ginjal (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus uteri (UCEC), adenokarsinoma paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0,05) (Gbr. 1e-m) . Analisis sampel sehat / tumor berpasangan lebih lanjut mengkonfirmasi ekspresi DARS-AS1 yang secara signifikan lebih tinggi pada tumor karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel jernih ginjal (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus uteri (UCEC), adenokarsinoma paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0,05) (Gbr. 1e-m) .Analisis sampel sehat/tumor berpasangan juga mengkonfirmasi ekspresi DARS-AS1 yang secara signifikan lebih tinggi pada karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel ginjal dan ginjal sel jernih (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), tumor karsinoma sel skuamosa paru (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , karsinoma endometrium korpus uteri (UCEC), adenokarsinoma paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0,05) (Gbr. 1e– m)./肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 (BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0,05）（图1e-m） ./肿瘤样本 证实 dars-os1 上 皮癌 皮癌 皮癌 肾 细胞癌 (prad) 细胞癌(lusc) 的 中 中 中 中 高 癌 lihc） kirp） coad） p <0.05）（图1e-m） .Analisis sampel pasangan sehat / tumor lebih lanjut mendukung peran DARS-AS1 dalam karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel ginjal sel jernih (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), dan tumor karsinoma sel skuamosa paru (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresi dalam karsinoma korpus uterin (UCEC), adenokarsinoma paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p <0,05) (Gambar 1e -m).Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa DARS-AS1 diekspresikan secara luas dan tinggi dalam berbagai jenis kanker.
Karena DARS-AS1 dan DARS (gen yang mengkode untai antisense) berbagi promotor yang sama dan terletak bersebelahan, kami merancang shRNA untuk secara khusus merobohkan DARS-AS1 tetapi bukan DARS (Gambar Tambahan 2a,b dan Tabel Tambahan 2) .Selain SW620, kami juga menggunakan tiga garis sel lain yang sangat mengekspresikan DARS-AS1 untuk mempelajari kemanjuran dan fungsi knockdown shRNA (Tabel Tambahan 3).Hasil kami menunjukkan bahwa ketiga shRNA yang dikembangkan mencapai setidaknya 80% efisiensi knockdown DARS-AS1 dengan sedikit efek pada jumlah mRNA DARS (Gambar Tambahan 2c-f).Selain itu, kami menemukan bahwa knockdown DARS-AS1 dengan shRNA ini secara signifikan menghambat pertumbuhan sel pada garis sel kanker kolorektal SW620 (49,7%) dan HCT116 (27,7%), garis sel kanker payudara MBA-MD-231 (53,4%).) dan garis sel hepatoma HepG2 (pengurangan 92,7%), serta kemampuannya untuk membentuk bola yang tidak terikat (pengurangan rata-rata ~50,8%, 44,6%, 40,7% dan 75,7% per garis sel) (Gbr. 2a,b).Di SW620, hasil uji pembentukan koloni lebih lanjut menegaskan bahwa DARS-AS1 shRNA secara signifikan menghambat proliferasi sel dengan penurunan rata-rata sekitar 69,6% (Gbr. 2c).
Pengaruh kontrol shRNA dan SHRNA DARS-AS1 pada proliferasi sel (a) dan pembentukan spheroid (b) dalam sel SW620, HCT116, MBA-MD-231, dan HepG2.c Pengaruh shRNA kontrol dan SHRNA DARS-AS1 pada pembentukan koloni dalam sel SW620.Proliferasi sel (d), pembentukan spheroid (e), dan pembentukan koloni (f) sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan.Data yang ditampilkan adalah mean ± standar deviasi dari tiga percobaan.* p 0,05, ** p 0,01, dan *** p 0,001 dengan uji-t Student dua sisi.
Untuk melengkapi studi kehilangan fungsi, kami selanjutnya membuat sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan (Gambar Tambahan 2g).Ekspresi berlebih DARS-AS1 secara signifikan meningkatkan pertumbuhan sel (1,8 kali lipat), pembentukan spheroid yang tidak terikat (1,4 kali lipat), dan pembentukan koloni (3,3 kali lipat) dalam sel SW620 (Gbr. 2d-f).Kami mengkonfirmasi hasil ini menggunakan garis sel pengekspresi DARS-AS1 lainnya, A549.Proliferasi sel yang ditingkatkan ini karena ekspresi berlebih DARS-AS1 diamati lebih lanjut dalam sel A549 (Gambar Tambahan 2h, i dan Tabel Tambahan 3).Secara keseluruhan, studi keuntungan dan kerugian ini menunjukkan bahwa DARS-AS1 mempromosikan proliferasi sel kanker secara in vitro.
Untuk mengeksplorasi mekanisme yang mendasari DARS-AS1 mengatur proliferasi sel, kami melakukan analisis pull-down RNA untuk mengidentifikasi mitra pengikat protein potensialnya.Hasil RT-qPCR menunjukkan bahwa sekitar 86,2% DARS-AS1 terletak di sitoplasma sel SW620 (Gambar Tambahan 3a).DARS-AS1 atau pseudoRNA yang ditranskripsi secara in vitro kemudian diinkubasi dengan lisat sel SW620 diikuti dengan pemisahan SDS-PAGE.Pewarnaan perak berikutnya menunjukkan bahwa pita yang berbeda (~ 38 kDa) secara signifikan diperkaya dalam sampel tarikan DARS-AS1 tetapi tidak pada sampel RNA atau manik-manik tiruan (Gbr. 3a).Pita ini diidentifikasi sebagai protein pengaktif PKR (PACT) dengan spektrometri massa (MS) dan selanjutnya dikonfirmasi dengan imunoblotting pada garis sel SW620, HCT116, dan HepG2 (Gbr. 3a,b).Pengayaan DARS dan protein PACT terkait – PKR dan TRBP – juga diselidiki menggunakan analisis RNA oleh Western blotting (WB).Hasilnya menunjukkan bahwa tidak ditemukan interaksi langsung antara RNA DARS-AS1 dan ketiga protein ini (Gambar Tambahan 3b).Interaksi spesifik antara DARS-AS1 dan PACT selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis RNA immunoprecipitation (RIP), yang menunjukkan bahwa DARS-AS1 secara signifikan diperkaya dalam antibodi anti-PACT tetapi tidak pada RNA kontrol lainnya (Gambar 3c).Untuk menentukan apakah DARS-AS1 berinteraksi langsung dengan PACT tanpa adanya komponen seluler lainnya, uji in vitro biolayer interferometry (BLI) dilakukan menggunakan PACT yang dimurnikan.DARS-AS1 atau dummy RNA berlabel biotin diimobilisasi pada biosensor streptavidin (SA) dan kemudian diinkubasi dalam buffer kinetik yang mengandung 1 M PACT.Khususnya, PACT terikat kuat pada DARS-AS1 (nilai KD ~ 26,9 nM), tetapi tidak untuk meniru RNA (Gambar 3d).Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan interaksi langsung dan afinitas tinggi antara DARS-AS1 dan PACT.
Analisis tarikan RNA mengidentifikasi DARS-AS1 berinteraksi dengan PACT dalam sel SW620.Di atas, pewarnaan perak dari protein terkait.Imunoblot yang lebih rendah dilakukan dengan antibodi anti-PACT.b Analisis pull-down RNA dilakukan dalam sel HCT116 (atas) dan HepG2 (bawah).Pengayaan PACT dideteksi dengan imunoblotting.Tes imunopresipitasi cRNA (RIP) dilakukan dalam sel SW620 menggunakan antibodi yang ditunjukkan.d Kurva pengikatan PACT ke DARS-AS1 full-length atau RNA kontrol diperoleh menggunakan biolayer interferometry (BLI).RNA diimobilisasi pada biosensor streptavidin.1 M PACT digunakan untuk mengukur asosiasi.e Uji tarik RNA dilakukan menggunakan DARS-AS1 full-length terbiotinilasi atau terpotong (atas).Immunoblot menunjukkan PACT diterima (bawah).f PACT berbendera yang dimurnikan diinkubasi dengan DARS-AS1 full-length terbiotinilasi atau dipotong (seperti pada e) untuk uji RIP in vitro.RNA yang diekstraksi diverifikasi oleh RT-qPCR.g Afinitas relatif dari fragmen RNA yang berbeda untuk PACT diperoleh dengan menggunakan interferometri biolayer.Untuk analisis, 100 nM RNA dan 1 M RAST digunakan.h Tes RIP in vitro dilakukan menggunakan PACT berlabel utuh atau terpotong yang dimurnikan.RNA yang diekstraksi diverifikasi oleh RT-qPCR.i Tingkat pertumbuhan sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1, PACT, atau keduanya secara berlebihan.j Overekspresi DARS-AS1 full-length atau terpotong dalam sel SW620 memiliki efek berbeda pada pertumbuhan sel.k Apoptosis dideteksi dengan imunoblotting dengan antibodi anti-PARP.l Knockout DARS-AS1 menginduksi apoptosis sel SW620 seperti yang ditunjukkan oleh flow cytometry.Data yang ditampilkan adalah mean ± standar deviasi dari tiga percobaan. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001, dengan uji t Student dua sisi. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001, dengan uji t Student dua sisi. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001 о ороннему ерию ента. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001 dengan uji-t Student dua sisi. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p <0,0001 о ороннему ерию ента. *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0,0001 dengan uji-t Student dua sisi.
Kami kemudian menghasilkan tiga fragmen RNA DARS-AS1 terbiotinilasi dengan transkripsi in vitro untuk mengidentifikasi wilayah DARS-AS1 yang diperlukan untuk asosiasi PACT (Gambar 3e).Hasil analisis RNA menunjukkan bahwa setiap fragmen mampu berinteraksi dengan PACT, tetapi wilayah terminal 3′ (384-768 nukleotida berlabel A3) menunjukkan lebih dari 1-384 nukleotida berlabel A1) (Gbr. 3e).Hasil serupa diamati dalam uji RIP in vitro menggunakan PACT rekombinan (Gambar 3f).Konsisten dengan hasil ini, percobaan untuk mengikat fragmen RNA amobil ke PACT menggunakan BLI juga menunjukkan bahwa PACT memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk A3 (384-768 nt) (nilai KD sekitar 94,6 nM), sementara hampir tidak ada hubungan dengan area lain.(Gbr. 3d).
Kami juga memeriksa daerah pengikatan terkait di PACT.PACT berisi tiga domain fungsional, dua di antaranya adalah domain pengikat RNA untai ganda (dsRBD) dan domain ketiga (ditunjuk D3) yang bertindak sebagai penggerak interaksi protein.Untuk memeriksa kapasitas pengikatan lncRNA dari setiap domain, kami merekayasa tiga mutasi yang menghapus masing-masing dari tiga domain dan melakukan uji RIP in vitro.Hasil kami menunjukkan bahwa penghapusan domain ketiga (D3) PACT secara signifikan mengurangi interaksinya dengan DARS-AS1 (sebesar 0,11 kali lipat dibandingkan dengan PACT utuh) dibandingkan dengan dua mutasi lainnya (Gbr. 3h), ditunjukkan bahwa pelepasan dari D3 berinteraksi dengan DARS.-AC1.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa interaksi antara DARS-AS1 dan PACT dapat terjadi terutama melalui ujung 3′ DARS-AS1 dan domain D3 PACT.
Kami mencatat bahwa DARS-AS1 tidak berpengaruh pada ekspresi PACT dan PACT tidak berpengaruh pada DARS-AS1 (Gambar Tambahan 3c).Kami kemudian memeriksa efek knockdown PACT pada pertumbuhan sel.Berbeda dengan DARS-AS1, sel relatif tumbuh 1,5–3 kali lebih cepat ketika PACT dirobohkan (Gambar Tambahan 3d).Hasil uji pembentukan koloni menunjukkan bahwa sel-sel membentuk koloni 2-3 kali lipat setelah pengobatan shRNA dengan PACT (Gambar Tambahan 3e).Untuk menguji apakah DARS-AS1 mengatur proliferasi sel melalui PACT, kami menghasilkan sel SW620 yang mengekspresikan PACT, DARS-AS1, atau keduanya secara berlebihan.Ekspresi berlebih dari PACT menunjukkan penghambatan proliferasi sel yang signifikan (Gambar 3i).Sementara ekspresi berlebih DARS-AS1 secara signifikan mendorong proliferasi sel, tidak ada perbedaan signifikan dalam tingkat pertumbuhan sel yang mengekspresikan DARS-AS1 dan PACT secara berlebihan.Hasil ini menunjukkan bahwa PACT dapat melawan peningkatan proliferasi yang disebabkan oleh ekspresi berlebih DARS-AS1.
Karena berbagai wilayah DARS-AS1 memiliki kemampuan pengikatan PACT yang berbeda, kami menyelidiki pengaruh relatifnya terhadap proliferasi sel dengan ekspresi berlebih yang berbeda dari fragmen DARS-AS1.Dibandingkan dengan dua fragmen lainnya, DARS-AS1 diekspresikan secara berlebihan pada ujung 3′ (384-768 nt), wilayah utama yang berhubungan dengan PACT di DARS-AS1, yang memiliki kemampuan tertinggi untuk merangsang proliferasi sel (Gbr. 3j).Hasil ini menunjukkan korelasi positif antara kapasitas pengikatan dan fungsi biologis DARS-AS1.
PACT telah dilaporkan sebagai protein pro-apoptosis19.Oleh karena itu, kami menyelidiki efek DARS-AS1 pada apoptosis.Seperti yang diharapkan, knockdown DARS-AS1 secara signifikan meningkatkan pembelahan PARP dalam sel SW620 dan meningkatkan proporsi sel annexin V-positif di SW620, HCT116, HepG2, dan garis sel MBA-MD-231 (Gbr. 3k).3).3f-h), menunjukkan bahwa efek anti-apoptosis DARS-AS1 dalam sel kanker berlawanan dengan fungsi PACT yang menginduksi apoptosis.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa mekanisme fungsi onkogenik DARS-AS1 mungkin melalui penghambatan fungsi PACT.
Selanjutnya, kami mengeksplorasi implikasi fungsional dari asosiasi DARS-AS1-PACT.PACT telah dilaporkan mengaktifkan PKR melalui interaksi langsung, yang selanjutnya meningkatkan fosforilasi eIF2α, menyebabkan penghapusan translasi dan apoptosis17.Pertama, kami memeriksa apakah DARS-AS1 memengaruhi lokalisasi seluler PACT dan PKR.Mikroskop fluoresensi confocal menunjukkan bahwa PACT dan PKR sangat terlokalisasi dalam sel SW620 dengan koefisien korelasi Pearson rata-rata 0,72.Sementara itu, ekspresi berlebih DARS-AS1 secara signifikan mengurangi ko-lokalisasi PACT dan PKR (rata-rata koefisien korelasi Pearson 0,61) (Gambar 4a).Untuk menyelidiki apakah DARS-AS1 dapat memodulasi interaksi PACT-PKR, kami melakukan uji co-imunopresipitasi (co-IP) dengan antibodi anti-PACT dalam lisat sel SW620.PKR sangat diperkaya dalam anti-PACT dalam sel kontrol, sementara pemulihan PKR berkurang secara signifikan dalam lisat dari sel yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan (Gbr. 4b).PACT dan PKR berlabel yang dimurnikan digunakan untuk uji pengikatan protein in vitro.Dengan demikian, mereka yang menyediakan DARS-AS1 tetapi tidak ada RNA kontrol menunjukkan interaksi PACT-PKR yang ditekan (Gambar 4c).Semua hasil menunjukkan bahwa DARS-AS1 mengganggu komunikasi PACT dan PKR.
a Co-lokalisasi PACT dan PKR dalam sel kontrol atau sel yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan diamati menggunakan mikroskop fluoresensi confocal.Inti diwarnai dengan DAPI.Hasil statistik diperoleh dari 16 foto.b Co-imunopresipitasi (co-IP) menggunakan antibodi anti-PACT dalam lisat sel sel kontrol SW620 atau sel yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan.c PACT berlabel, PKR murni dan ditranskripsi in vitro dengan DARS-AS1 atau RNA tiruan diinkubasi untuk analisis pengikatan protein in vitro.Antibodi anti-flag digunakan untuk imunopresipitasi.d Imunoblot dengan antibodi yang ditunjukkan dilakukan dalam sel SW620 dan HCT116 yang ditransfeksi dengan shRNA kontrol atau DARS-AS1-shRNA diikuti oleh kelaparan serum.e Tingkat ekspresi DARS-AS1 mengubah sensitivitas seluler terhadap thapsigargin.Sel SW620 ditransfeksi dengan DARS-AS1 shRNA, plasmid ekspresi berlebih DARS-AS1 atau plasmid kontrol.Sel diperlakukan dengan thapsigargin selama 48 jam dan viabilitas sel ditentukan menggunakan reagen MTS.f DARS-AS1 atau RNA tiruan yang ditranskripsi secara in vitro dan PACT yang dimurnikan digunakan untuk uji aktivasi in vitro dan deteksi imunoblot.g Imunoblot menggunakan antibodi ini dilakukan pada sel SW620-ctrl (kiri) atau sel yang mengekspresikan mutan PKR (kanan).Sel-sel ini kemudian ditransfeksi dengan shRNA kontrol atau DARS-AS1-shRNA diikuti oleh kelaparan serum.h Flow cytometry menunjukkan bahwa inaktivasi PKR mutan mengkompensasi apoptosis yang diinduksi DARS-AS1 dalam sel SW620.i Imunoblot dengan antibodi yang ditunjukkan dilakukan di sel SW620 (kiri) atau HCT116 (kanan).Sel yang ditransfeksi dengan shRNA kontrol atau SHRNA DARS-AS1 tidak memiliki serum dan dilengkapi dengan inhibitor PKR C16 100 nM atau DMSO.Bilah skala = 5 m.Data yang ditampilkan adalah mean ± standar deviasi dari tiga percobaan.* p 0,05 Uji-t Student dua sisi.
Secara umum diyakini bahwa begitu PACT berinteraksi dengan PKR17, fosforilasi PKR pada Thr451 dapat diinduksi.Hasil kami menunjukkan bahwa tingkat fosforilasi PKR meningkat secara signifikan dalam sel knockdown DARS-AS1 setelah kelaparan serum (Gbr. 4d dan Gambar Tambahan 4a).Dengan demikian, kami menemukan bahwa fosforilasi eIF2α, substrat PKR utama, juga meningkat secara signifikan oleh DARS-AS1 shRNA (Gbr. 4d dan Gambar Tambahan 4a).Thapsigargin adalah stressor ER yang menyebabkan ER melepaskan Ca2+.Pengobatan dengan thapsigargin telah dilaporkan menginduksi ekspresi dan aktivasi PACT, yang selanjutnya berinteraksi dengan dan mengaktifkan PKR, menyebabkan apoptosis dengan meningkatkan fosforilasi eIF2α 18,61 .Di sini, kami menggunakan thapsigargin sebagai stimulator jalur PACT/PKR untuk menyelidiki apakah DARS-AS1 dapat membantu sel mengatasi stres dengan menghambat jalur PACT/PKR.Kami mengamati bahwa tingkat ekspresi DARS-AS1 berkorelasi positif dengan resistensi sel terhadap thapsigargin.Sel-sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan bertahan lebih baik ketika diobati dengan thapsigargin, sementara sel-sel dengan knockdown DARS-AS1 menjadi lebih rentan (Gbr. 4e).Konsisten dengan hasil ini, ekspresi berlebih DARS-AS1 mengurangi fosforilasi PKR yang diinduksi thapsigargin (Gambar Tambahan 4b).Sebaliknya, setelah pengobatan thapsigargin, PKR dan eIF2α terfosforilasi ke tingkat yang lebih tinggi dalam sel knockdown DARS-AS1 dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar Tambahan 4b).Menariknya, thapsigargin menginduksi ekspresi DARS-AS1 dengan cara yang bergantung pada dosis, yang mungkin menunjukkan fungsi anti-stres DARS-AS1 (Gambar Tambahan 4c).Selain itu, kami melakukan uji aktivasi in vitro untuk mengkonfirmasi pengamatan ini.Secara singkat, PKR dimurnikan dari lisat sel menggunakan antibodi anti-PKR, kemudian diinkubasi dengan PACT rekombinan dan DARS-AS1 yang ditranskripsi secara in vitro.Setelah reaksi enzimatik, fosfo-PKR dideteksi menggunakan WB.Hasil kami menunjukkan bahwa fosforilasi PKR secara signifikan dihambat oleh DARS-AS1, tetapi tidak oleh RNA kontrol (Gambar 4f).Hasil in vitro dan in vivo ini menunjukkan bahwa DARS-AS1 menghambat aktivasi PKR yang dimediasi PACT.Pada saat yang sama, kami juga mengamati penurunan pemulihan PACT dengan adanya DARS-AS1 (Gambar 4f).Hasil ini konsisten dengan hasil uji pengikatan protein in vitro (Gambar 4c) dan sekali lagi menggambarkan fungsi pemblokiran DARS-AS1 untuk asosiasi PACT-PKR.
Ser246 dan Ser287 dalam domain D3 dari PACT diperlukan untuk aktivasi PKR di bawah tekanan seluler.Substitusi dua residu serin untuk alanin memberikan PACT mutan (mutD), yang mengaktifkan PKR tanpa adanya stres, dan substitusi untuk alanin (mutA) membalikkan protokol.Karena kami telah menunjukkan pentingnya domain ini dalam hubungan langsung dengan DARS-AS1, kami menghasilkan dua mutan PACT ini untuk menguji apakah residu ini juga dapat terlibat dalam interaksi dengan DARS-AS1.Menariknya, kedua mutan kehilangan kemampuan untuk mengikat DARS-AS1 (Gambar Tambahan 4d), menunjukkan bahwa struktur lengkap protein PACT mungkin diperlukan untuk interaksi yang efisien dengan DARS-AS1.
Lebih lanjut, hasil kami juga menunjukkan bahwa penghambatan proliferasi sel yang diinduksi DARS-AS1-shRNA dapat dipulihkan sebagian dengan mengekspresikan mutan PACT negatif dominan (PACTmutA) atau mutan PKR negatif dominan (PKRmut) (Tambahan Gambar. 4e. e).Ekspresi berlebih dari mutan PKR dominan-negatif mengurangi fosforilasi PKR yang diinduksi oleh knockdown DARS-AS1 serta fosforilasi eIF2α dalam sel yang kekurangan serum (Gbr. 4g).Lebih penting lagi, proporsi sel apoptosis yang diinduksi oleh knockdown DARS-AS1 juga berkurang pada sel yang mengekspresikan PKRmut secara berlebihan (Gbr. 4h dan Gambar Tambahan 4g).Penghambatan aktivitas PKR kinase juga merusak fungsi DARS-AS1, karena hasil menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 jarang memicu fosforilasi PKR dan eIF2α ketika sel diperlakukan dengan inhibitor C16 spesifik PKR (Gbr. 4i dan Gambar Tambahan. 4h).).Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa DARS-AS1 mempromosikan proliferasi sel, setidaknya sebagian, dengan menghambat aktivasi PKR yang dimediasi PACT.
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran DARS-AS1 dalam tumorigenesis, kami melakukan percobaan in vivo menggunakan model xenograft tikus. Hasil menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 secara dramatis menurunkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0,0001) (Gbr. 5a). Hasil menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 secara dramatis menurunkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0,0001) (Gbr. 5a). езультаты оказывают, о окдаун DARS-AS1 езко ает ост опухоли ей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Hasilnya menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 secara drastis mengurangi pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p < 0,0001) (Gambar 5a).DARS-AS1 p < 0,0001）（图5a）。DARS-AS1 p值<0,0001）（图5a）。 езультаты оказали, о окдаун DARS-AS1 ачительно ает ост опухоли ей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Hasil penelitian menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 secara signifikan mengurangi pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p < 0,0001) (Gambar 5a).Jadi, pada kelompok knockdown DARS-AS1, ada penurunan signifikan dalam volume tumor rata-rata sekitar 72,9% dan massa tumor rata-rata sekitar 87,8% (Gambar 5b-d).Hasil ini sangat menyarankan bahwa DARS-AS1 dapat secara signifikan meningkatkan pertumbuhan tumor in vivo.
Efek knockdown iklan DARS-AS1 pada onkogenesis kolorektal pada tikus telanjang.Kurva pertumbuhan (a), ukuran tumor (b), berat (c), dan gambar tumor (d) ditampilkan.Bilah kesalahan mewakili ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, dengan uji t Student dua sisi. n = 10. ****p < 0,0001, dengan uji t Student dua sisi. n = 10. ****p < 0,0001 о ороннему ерию ента. n = 10. ****p < 0,0001 Uji-t Student dua sisi.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 о ороннему ерию ента. ****p < 0,0001 Uji-t Student dua sisi.e Kaplan-Meier menganalisis korelasi antara tingkat ekspresi DARS-AS1 dan kelangsungan hidup secara keseluruhan pada pasien dengan UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, dan LGG.Tingkat ekspresi DARS-AS1 yang tinggi pada pasien berada di 50% teratas;tingkat ekspresi DARS-AS1 yang rendah pada pasien berada di bawah 50%.nilai-p ditentukan dengan menggunakan uji peringkat log.f Model yang diusulkan di mana DARS-AS1 mengatur jalur PACT-PKR dan pertumbuhan tumor.
Untuk lebih memahami dampak klinis DARS-AS1, kami memeriksa korelasi antara ekspresinya dan kelangsungan hidup pasien.Dengan menganalisis dataset TCGA, kami menemukan bahwa ekspresi DARS-AS1 yang lebih tinggi dikaitkan dengan uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multipleks.Kelangsungan hidup yang lebih rendah secara signifikan terkait dengan morfosis glioblastoma (GBM) dan pasien dengan glioma otak tingkat rendah (LGG) (Gambar 5e).Hasil ini menunjukkan bahwa DARS-AS1 mungkin memainkan peran penting dalam perkembangan tumor klinis dan mungkin menjadi biomarker prediktif potensial pada beberapa kanker.
Dalam penelitian ini, menggunakan skrining fungsional CRISPRi skala besar, kami menentukan bahwa DARS-AS1 lncRNA mengatasi stres sel kanker dengan mengatur dua responden stres utama, PACT dan PKR.Dengan berinteraksi langsung dengan PACT, DARS-AS1 menghambat aktivasi PKR yang dimediasi PACT, sehingga mencegah kematian sel apoptosis dan mendorong proliferasi sel (Gbr. 5f).Peningkatan regulasi DARS-AS1 telah diamati pada beberapa jenis kanker, menunjukkan bahwa fungsinya untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel kanker dalam kondisi stres dapat diterapkan secara luas untuk berbagai jenis kanker.
PACT telah diidentifikasi sebagai protein aktivator PKR, dan aktivasi PKR yang dimediasi PACT memainkan peran penting dalam respons stres dengan mengatur transkripsi, translasi, apoptosis, dan proses seluler penting lainnya62.Selama beberapa dekade, upaya telah dilakukan untuk memahami regulasi spesifik kanker dari kaskade PACT-PKR.Di sini, penelitian kami mengungkapkan mekanisme regulasi PACT-PKR yang berbeda dalam sel kanker melalui seluler lncRNA DARS-AS1, yang secara langsung mengikat PACT, memblokir interaksi PACT-PKR, menghambat aktivasi PKR dan fosforilasi eIF2α, sehingga menghambat apoptosis yang diinduksi stres dan merangsang proliferasi kanker akhirnya.sel.Penemuan ini menyoroti target lncRNA potensial untuk prognosis dan terapi kanker.
Data kami menunjukkan bahwa knockdown DARS-AS1 membuat sel peka terhadap kelaparan serum dengan peningkatan signifikan pada PKR dan eIF2α terfosforilasi.Hasil ini menunjukkan bahwa DARS-AS1 mempromosikan kelangsungan hidup sel kanker dalam kondisi yang keras dengan menghambat aktivitas PACT/PKR.Beberapa RNA non-coding lainnya, seperti ASPACT dan nc886, juga terlibat dalam sumbu PACT/PKR dengan menurunkan regulasi mRNA PACT48 atau mengatur autofosforilasi dengan mengikat PKR49,50,64.Diantaranya, DARS-AS1 bertindak sebagai pengganggu asosiasi PACT-PKR.Studi ini memperkaya pemahaman kita tentang regulasi sumbu PACT / PKR dan peran lncRNA dalam respons stres.
PACT berisi tiga domain terpisah.Masing-masing dari dua dsRBD pertama cukup untuk mencapai pengikatan afinitas tinggi PACT ke PKR, sedangkan domain ketiga (D3) diperlukan untuk aktivasi PKR in vitro dan in vivo.Studi kami menunjukkan bahwa DARS-AS1 secara istimewa berinteraksi dengan domain D3 (Gbr. 3h).Mengingat ukuran besar lncRNA (768 nukleotida), pengikatan DARS-AS1 ke D3 dapat secara fisik menghambat interaksi antara domain PACT dari dsRBD dan PKR, sehingga menghalangi asosiasi PACT dan PKR.Mutasi titik PACT yang menggantikan Ser246 dan Ser287 di D3 dengan alanin atau aspartat mengganggu afinitas pengikatannya untuk DARS-AS1, menunjukkan pentingnya keseluruhan sifat struktural dan listrik D3 dalam hubungannya.Rincian lebih lanjut dari mekanisme ini akan diperlukan di masa depan, menggunakan analisis biokimia yang lebih tepat dan analisis struktural PACT resolusi tinggi.
Studi sebelumnya telah melaporkan bahwa DARS-AS1 mendorong proliferasi sel melalui beberapa mekanisme51,52,53.Dalam satu contoh, para peneliti mengamati bahwa DARS-AS1 meningkatkan regulasi gen DARS penyandi protein antisense dengan menargetkan miP-194-5p dalam sel kanker ginjal.Namun, dalam penelitian ini, knockdown DARS-AS1 memiliki sedikit efek pada transkripsi DARS pada berbagai jenis kanker, termasuk setidaknya kanker kolorektal, payudara, dan hati.Karena lncRNA menunjukkan pola ekspresi spesifik sel dan jaringan, mekanisme fungsional mungkin tidak dipertahankan di seluruh jenis kanker, yang dapat berkontribusi pada perbedaan antara pengamatan kami dan penilaian sebelumnya dari berbagai kanker.Studi khusus diperlukan untuk menjelaskan mekanisme spesifik dari berbagai proses fisiologis dan patologis.
Analisis data klinis menunjukkan bahwa ekspresi DARS-AS1 pada tumor berkorelasi terbalik dengan kelangsungan hidup pasien kanker, yang menggarisbawahi pentingnya sumbu DARS-AS1/PACT/PKR dalam prognosis kanker.Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa DARS-AS1 adalah pengatur sumbu pensinyalan PACT / PKR, mendorong proliferasi sel kanker, dan menghambat apoptosis selama respons stres, yang menyediakan jalur penelitian lain dan menarik untuk penelitian masa depan tentang perawatan potensial. .
Garis sel manusia SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 dan HEK293T diperoleh dari Infrastruktur Sumber Daya Jalur Sel Nasional di Cina.Semua sel dipelihara dalam media DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) yang dilengkapi dengan 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) dan 1% penisilin-streptomisin (Thermo Fisher Scientific) pada 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Bendera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);IgG tikus normal, CST (5415S);IgG kelinci normal, CST (2729S).Antibodi diencerkan 1:1000 dalam PBST untuk Western blotting dan 1:100 untuk IP.
sgRNA dikembangkan menggunakan alat yang tersedia untuk umum yang disebut CRISPR-ERA66.Kami menggunakan parameter alat default untuk pengembangan sgRNA dan algoritma menghitung situs pengikatan sgRNA di wilayah 3 kb.berpusat di TSS.Kumpulan oligonukleotida sgRNA disintesis di CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) dan diklon ke plasmid pgRNA yang dimanusiakan (Addgene #44248).Sebanyak 12 g plasmid pgRNA manusiawi yang dikumpulkan, 7,2 g psPAX2 (Addgene #12260), dan 4,8 g pMD2.G (Addgene #12259) ditransfeksi bersama ke dalam 5 x 106 HEK293T dalam cawan 10 cm menggunakan Reagen Transfeksi DNAfect sel ( CWBIO, Beijing, China) mengikuti instruksi pabrik.Supernatan yang mengandung virus dikumpulkan 48 dan 72 jam setelah transfeksi dan disaring melalui filter 0,45 m.Untuk skrining, sel SW620 yang mengekspresikan protein fusi dCas9 / KRAB diperoleh dengan transduksi virus.Sel SW620 yang dimodifikasi terinfeksi dengan perpustakaan virus dalam empat percobaan infeksi independen pada MOI 0,1-0,3 dan diambil sampelnya dengan 2 g/ml puromisin (Sigma, St. Louis, MO) selama 2 hari.Setelah itu, sel dikultur selama 18 hari secara in vitro dengan cakupan perpustakaan minimum 500 sel/sgRNA untuk skrining.
DNA genom diekstraksi sesuai dengan instruksi dari QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Jerman; 51183).Secara total, 100 g DNA genom per pengulangan biologis digunakan untuk membangun perpustakaan.Wilayah sgRNA diamplifikasi oleh dua putaran PCR dan ditautkan ke kode batang.
Produk PCR dimurnikan menggunakan gel NucleoSpin® dan kit pemurnian PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jerman; 740609.250) dan diukur menggunakan kit deteksi DNA untai ganda Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Uji MTS digunakan untuk mengukur proliferasi sel.Sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan awal 2000 sel / sumur.Jumlah relatif sel diukur setiap hari pada waktu yang ditentukan untuk total 4-6 hari.Untuk setiap sumur, 20 l reagen MTS (Promega) diencerkan dengan 100 l DMEM, diinkubasi dengan sel selama 4 jam pada suhu 37°C, dan kemudian diukur OD490.
Kapasitas untuk pertumbuhan yang tidak terikat ditemukan dengan menganalisis pembentukan bola.Secara singkat, 2000 sel yang ditransfeksi dengan shRNA DARS-AS1 atau shRNA kontrol dikultur dalam pelat mikro perlekatan sangat rendah (Corning) dengan perubahan sedang setiap 4 hari.Spheroid dihitung setelah 14 hari.500 sel yang ditransfeksi dengan plasmid ekspresi berlebih DARS-AS1 atau plasmid kontrol digunakan untuk pengujian peningkatan, jika tidak, metodenya tidak berubah.
RNA ditranskripsi menggunakan T7 RNA polimerase dan biotin-16-UTP (Roche 1138908910) sesuai dengan instruksi Sistem Kombinasi Riboprobe® (Promega P1440).Primer yang digunakan di sini tercantum dalam Tabel Tambahan 4.
Daerah PACT atau PKR pengkode protein diklon ke pET15b (Addgene #73619) dan diubah menjadi BL21(DE3).Bakteri diinkubasi semalaman dalam LB yang disuplai dengan ampisilin dan kemudian diencerkan 100 kali lipat dengan LB segar.Ketika OD600 medium mencapai 0,8, 1 mM IPTG ditambahkan untuk menginduksi ekspresi protein.Setelah inkubasi semalaman dengan pengocokan lembut (250 rpm pada 20 ° C), pelet sel dikumpulkan dengan sentrifugasi (4000 rpm, 10 menit, 4 ° C).Suspensi sel pelet dalam buffer lisis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) dan inkubasi di atas es selama 30 menit, kemudian sonikasi (15 menit, 5 detik hidup/mati, di atas es) dan sentrifus (13.000 rpm)., 30 menit, 4°С).Supernatan kemudian dimasukkan ke resin Ni-NTA (QIAGEN) 3 kali pada suhu 4°C, dicuci 4 kali dengan buffer pencuci (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) dan dielusi 3 kali, dengan total dari 10 ml buffer eluen (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Protein yang dimurnikan ditentukan menggunakan WB dan konsentrasinya ditentukan dengan menggunakan kit uji protein Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Pengujian RIP dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan modifikasi.Secara singkat, 1x buffer RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) melisiskan sitostatik 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) dan sentrifus pada 13.000 rpm selama 15 menit pada 4 °C.Supernatan kemudian diinkubasi dengan manik-manik magnetik protein A+G (Millipore) terkonjugasi dengan 5 g antibodi anti-PACT (Abeam) atau IgG (CST).Manik-manik dicuci 5 kali dengan buffer RIP 5x, kemudian dicerna dengan proteinase K (NEB).RNA diekstraksi dengan Trizol dan ditentukan dengan RT-qPCR.Primer disajikan dalam Tabel Tambahan 5.
Uji RIP in vitro dilakukan sesuai dengan protokol uji standar RIP yang dimodifikasi.Sebanyak 5 pmol RNA yang ditranskripsi secara in vitro diencerkan 1x dengan buffer RIP dan dianil dengan inkubasi pada suhu 65°C selama 5 menit diikuti dengan pendinginan lambat hingga suhu kamar.Sebanyak 5 pmol protein PACT berlabel bendera utuh atau bermutasi dimurnikan dari E. coli.Inkubasi dengan RNA renaturasi selama 2 jam pada suhu 4°C dan ikuti prosedur di atas untuk analisis RIP untuk IP anti-bendera.
Untuk analisis ekstensi RNA, sel 1 × 107 dilisiskan dengan buffer 1xRIP.Setelah disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C, supernatan diberi perlakuan awal dengan 30 l manik-manik magnetik streptavidin (Beckman) selama 2 jam pada suhu 4°C.Lisat yang dimurnikan kemudian disuplai dengan tRNA ragi dan diinkubasi dengan 40 pmol RNA renaturasi semalaman pada suhu 4 ° C, kemudian selama 2 jam dan 20 l manik-manik magnetik streptavidin baru yang diblokir dengan BSA ditambahkan.Tahap pencucian terdiri dari 4 kali dengan 5x buffer RIP dan 4 kali dengan 1x buffer RIP.Protein yang sesuai dielusi dengan buffer elusi biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) dan dipisahkan pada NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Setelah pewarnaan perak (Beyotime Biotechnology), pita tertentu dipotong dan dianalisis dengan MS.
Analisis Co-IP dilakukan untuk menguji interaksi antara PACT dan PKR.Secara singkat, lisat supernatan disiapkan dengan menginkubasi 1 x 107 sel yang dilisiskan dalam 1 x buffer RIP diikuti dengan sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C.Lisat dimuat dengan manik-manik magnetik protein A + G, dikonjugasikan dengan 5 g antibodi anti-PACT, dan diputar dengan lembut semalaman pada suhu 4 ° C.Manik-manik dicuci 3 kali dengan buffer 5xRIP, dua kali dengan buffer 1xRIP dan dielusi dengan buffer 1xSDS.Protein yang diperoleh kembali dianalisis dengan gel SDS-PAGE dan dideteksi oleh WB.
Dua pmol dari PACT berbendera dan 1 pmol dari PKR dimurnikan dari E. coli.Encerkan dalam buffer 1x RIP dan inkubasi dengan 10 pmol RNA renaturasi selama 2 jam pada suhu 4 °C.Setelah itu, mereka diinkubasi dengan antibodi anti-label terkonjugasi manik-manik magnetik protein A+G selama dua jam tambahan.Manik-manik kemudian dicuci empat kali dengan buffer 1x RIP dan dielusi dengan buffer SDS 1x.PACT dan PKR yang dihasilkan dideteksi oleh WB.